桃小食心虫病原真菌系列

1、桃小食心虫病原真菌【摘要】：桃小食心虫 （简称桃小 ）是危害严重的果树食心虫类害虫。 可应用病原真菌在土壤中对越冬老熟幼虫感染致病进行生物防治。 由 于病原真菌能在土壤中长期宿存 ,被感染的幼虫又作为新的感染源 ,从 而可对桃小的种群数量起到持续控制作用。 本文采用从自然染病的桃 小越冬虫尸上分离病原真菌的方法 ,分离筛选出对桃小致病力高的一 株病原真菌 ,对其进行形态学与分子鉴定 ,确定种属地位。系统地研究 了该菌株对桃小幼虫的致病力 ,侵染桃小的致病过程以及桃小感染后 的组织病理学特征和生理生化防御反应。 并对该菌株的生物学特性与 菌粉的制备 ,野外防治效果 ,菌株在自然环境中的宿存情况以

2、及与常用 化学杀虫剂的相容性进行了研究 ,为应用该菌株对桃小进行生物防治 提供理论和应用依据。研究结果如下： 1.从桃小的越冬虫尸上分离并 筛选出一株对桃小致病力高的病原真菌 TST05。通过回接实验证实其 为桃小的病原真菌。该菌株在 PDA 培养基上的培养菌落初为白色毛 绒状 ,后产生浓密的黄色粉状孢子。具有白僵菌属典型的特征 ,产孢轴 末端 “之”字型弯曲且孢子着生在小齿突上。 产孢细胞多浓密簇生 ,显微 镜下可见球状密集的孢子头。分生孢子卵圆形或近球形。应用 rDNAITS 序列分析方法对其进行分子鉴定。结合形态学和分子鉴定 结果确定 TST05 菌株为白僵菌属 Beauveria 的

3、球孢白僵菌 Beauveriabassiana。2.测定了 TST05 菌株对桃小老熟幼虫的致病力。结果显示 ,107-109 孢子 /mL 的孢子悬浮液感染幼虫 ,9d 的累积校正致死率可达到 68.57%97.50%。并且 TST05 菌株的致死速度较快 ,染菌 2d 后幼虫开始死亡 ,死亡高峰集中于处理后 4-7d。随孢子浓度增大 , 幼虫的死亡高峰时间也随之提前并缩短。致死中时 LTso 随孢子浓度 增加由 6.57d缩短至 4.31d。致死中浓度 LC50 从4d的 2.16 109孢子 /mL降低到6d的4.36 106孢子/mL。研究结果表明 ,TST05菌株对桃 小幼虫有较高的

4、致病力 ,且致死速度较快 ,可作为防治桃小的优良菌 株。该菌株已保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心, 编号为CGMCC4526。3.采用光学显微镜、扫描电镜、透射电镜技术 ,系统地 观察研究了 TST05 菌株孢子在桃小幼虫体表的附着、萌发、菌丝穿 透体壁的过程和对内部组织的侵染及其引起的组织病理学变化。 研究 发现 ,桃小幼虫头壳硬而光滑 ,孢子附着很少 ,但在触角的基部和口器 的皱褶处孢子附着较多。在幼虫胸部和腹部 ,体表着生密集的棘刺和 稀疏的长刚毛 ,孢子主要附着在棘刺基部的体表上。在气门附近和光 滑的刚毛上也发现有孢子的附着。 孢子萌发后入侵的途径是穿透幼虫 体壁。在染菌 24-3

5、6h,孢子萌发出芽管直接穿透体表或在菌丝前端生 成侵入钉侵入表皮。 真菌的入侵可破坏原表皮层中的蛋白 几丁质片 层结构。在真菌入侵过程中 ,幼虫表皮中出现黑斑、血淋巴中出现黑 化体,显示幼虫体内免疫防御系统作出抵抗反应。真菌进入幼虫血腔 后,产生大量芽生孢子并侵入幼虫内部组织器官。观察到脂肪体、消 化道、马氏管、肌肉组织的感染症状 ,以及真菌对幼虫丝腺腔中的丝 胶层和液体丝素的侵染和占据过程。最终 ,菌丝冲破虫尸的体壁 ,从虫 尸内长出并产生新的分生孢子作为新的感染源感染其它寄主。 研究结果直观地揭示了 TST05 菌株对桃小幼虫的感染过程。 4.桃小幼虫对 TST05 菌株感染的生理生化反应

6、试验表明 ,在受到真菌侵染后 ,桃小幼 虫体内的营养物质海藻糖和蛋白质的含量明显下降,葡萄糖含量先升后降。同时 ,感染后虫体内海藻糖酶活性升高 ,5d 时达到了对照组的 1.91倍。感染后 ,幼虫体内起免疫防御及保护作用的多酚氧化酶 (PO)、 谷胱甘肽 -S-转移酶(GSTs)、羧酸酯酶 (CarE)、超氧化物歧化酶 (SOD)、 过氧化物酶 (POD)和谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px)的活性都表现出 先升后降的趋势。 其中 GSTs和 GSH-Px 受感染影响变化最大 ,在染菌 3d后分别达到对照组的 3.84倍和 3.95倍。 SOD和 POD酶活力在感 染后 3d比对照组高出 0.

7、61倍和 0.53倍。PO和 CarE的活性在感染 5d 后达到了最高值 ,分别达到对照组的 1.48 和 1.50 倍。表明 TST05 菌株的侵染 ,对桃小幼虫的营养代谢产生影响 ,并诱发了其生理防御反 应。染菌后虫体内的过氧化氢酶 (CAT)活性始终都低于对照组 ,最低时 仅为对照组的 56.78%,显示 TST05 菌株的入侵对 CAT 酶有较强的抑 制或破坏作用。同时发现 ,感染 TST05 菌株可导致桃小幼虫体内乙酰 胆碱酯酶 (AChE) 的酶活性升高 ,显示该菌株的感染或其代谢毒素可能 对幼虫的神经传导有影响。 5.测定不同培养基、不同温度和湿度对该 菌株的菌丝生长、孢子产量、

8、及孢子萌发的影响。 发现该菌株在 PDA、 PPDA、 SDAY、SMAY4 种培养基上均生长良好 ,菌落厚而致密 ,产孢 量均大于 3.95 107 孢子/mL；菌株适应的温度和湿度范围较宽 ,15 30之间,相对湿度 (RH)30%-100%之间孢子均可萌发、生长和产孢。随着温度接近 25、湿度增大 ,孢子的萌发率、菌落的生长速率和产孢量都显著增加。15、RH100%时产孢量为 1.32 107孢子/mL；25、 RH30%时,产孢量也能达到 1.37 107/mL ；25、RH100%时产孢量达 到 6.19 107 孢子/mL 。15、 RH100%孢子萌发率为 52.28%； 25、

9、 RH80%时,孢子萌发率都能达到 90%以上。表明 TST05 菌株易于培养 , 能适应北方干旱低温条件 ,可开发成为防治桃小的生物制剂。 6.试验制 备了 TST05 菌株的菌粉制剂。采用楔形瓶和两端插入玻璃通气管的 塑料袋作为 TST05 菌株的固体培养容器。结果显示 ,该菌株在两种培 养容器中都能旺盛生长 ,培养基表面都已经长满白色浓密的菌丝。通 过检测产孢量和胞外蛋白酶活性 ,证实培养 20d 后塑料袋中菌粉产孢 量为 12.50x109 孢子 /g,蛋白酶活性达到了 770.34U/mgpr,分别是楔形 瓶中菌粉的 1.42倍和 1.54倍。表明通气效果好更有利于 TST05 菌株

10、 的生长和产孢。 7.进行了果园防治应用试验。 在 9 月份,当钻蛀在枣果 内的桃小幼虫老熟脱果入土期 ,用制备的菌粉制剂与土壤按 1：200 的 比例拌匀后均匀撒施于枣树下 ,将桃小老熟幼虫撒在土上由其自然入 土,试验入土幼虫的感染死亡率。结果显示 ,菌粉制剂对桃小幼虫的野 外校正致死率达到 75.29%,具有较好的应用前景。 8.试验了 TST05 菌 株菌株在土壤中的存活能力。如上述果园防治试验的方法 ,在 9 月份, 将菌粉制剂撒于果园枣树下的表土层中 ,4 个月后采样 ,在实验室培养 测得成菌落数为 1.09 104CFU/g,比初始的 108.67104CFU/g 下降了 两个数量

11、级 ,但随后几个月中 ,成菌落数一直较为稳定 ,甚至略有回升。 6 个月和 8 个月后从土壤中直接分离的菌株的产孢量也较稳定 , 达到 106 孢子/mL。说明该菌株在野外土壤中具有高的存活能力 ,有利于对桃小种群数量的持续控制。 9.研究了 TST05 菌株菌株与 7 种常用化学 杀虫剂的相容性。采用高效氯氰菊酯、高氯甲维盐、辛硫磷、高效氯 氟氰菊酯、阿维菌素、阿维杀虫单、虫酰肼 ,试验它们对 TST05 菌株 的生长、孢子萌发、产孢的影响。结果表明 ,在林间常用浓度下 ,7 种 杀虫剂对该菌株的菌丝生长抑制率在 27.93% 38.74%之间。在虫酰 肼处 理组 ,孢 子萌发 率 为 33

12、.19%,几乎 不 形成 菌 落 ,产 孢 量仅为 0.05 106 孢子 /mL ；而在其余 6 种杀虫剂处理组 ,孢子萌发率在 50.34% 70.62%之间,能形成较致密的菌落 ,产孢量为 2.513.58 106 孢子 /mL。杀虫剂对该菌株的抑制作用随着浓度的降低而减小 ,林间浓 度再稀释 5 倍后,各处理组的孢子萌发率升高到 72.08%84.92%：产 孢量为 3.019.61106孢子/mL。显示,TST05 菌株与除虫酰肼之外的 其余 6 种杀虫剂的相容性较好 ,并且相容性随着杀虫剂浓度的降低而 提高。【关键词】：球孢白僵菌桃小食心虫病原真菌致病力组织病理学 生理反应生物学特

13、性【学位授予单位】：山西大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2013【分类号】：S476.1目录】：中文摘要 12-16Abstract16-22第一章前言 22-261.1 桃小食心 虫的危害及防治 22-231.2 球孢白僵菌在生防中的应用及致病作用研 究 23-251.3 本文研究的内容、目的及意义 25-26 第二章病原真菌 TST05 菌株的分离鉴定及其对桃小的致病力研究 26-352.1 材料与方 法 26-282.1.1样本采集及病原真菌的分离 262.1.2 回接试验 26-272.1.3 病原真菌 TST05 菌株的鉴定 272.1.3.1形态学鉴定 272.1.3.2T

14、ST05菌 株的分子鉴定 272.1.4TST05菌株的致病力测定 27-282.2 结果与分析 28-332.2.1TST05 菌 株 的 分 离 及 对 桃 小 幼 虫 的 感 染 症 状 28-292.2.2TST05 菌株鉴定结果 29-312.2.2.1 培养性状与形态特征 29-302.2.2.2分子鉴定及系统发育分析 30-312.2.3TST05菌株对桃小幼 虫的致病力 31-332.3 讨论 33-35 第三章桃小幼虫感染 TST05 菌株后 的组织病理学变化 35-553.1 材料和方法 35-363.1.1桃小幼虫与 TST05 菌株孢子悬浮液 353.1.2 桃小幼虫的

15、染菌处理 353.1.3 病理症状与组织 切片的显微观察 35-363.1.4组织病理学变化的电镜观察 363.2 结果与 分析 36-523.2.1 染菌后的桃小幼虫外部症状 36-383.2.2TST05菌株孢 子在桃小幼虫体表的附着、 萌发与入侵 38-423.2.3 菌丝对幼虫体壁的 穿透 42-443.2.4菌丝侵入血淋巴 44-453.2.5 幼虫内部组织器官的感染 症状 45-513.2.6TST05菌株从桃小虫尸上的再释放 51-523.3讨论 52-55 第四章桃小感染 TST05 菌株后的生理生化反应 55-684.1 材料与方法 55-574.1.1 桃小幼虫的染菌处理

16、554.1.2 幼虫体内海藻糖酶活性和海 藻糖、葡萄糖、蛋白质含量测定 55-564.1.3 多酚氧化酶活性测定 564.1.4解毒酶、保护酶、乙酰胆碱酯酶活性测定 56-574.1.5 数据分析 574.2 结果与分析 57-664.2.1TST05 菌株感染对幼虫体内营养代谢的 影响 57-604.2.2TST05 菌 株 感染对桃 小幼虫 多 酚氧 化 酶 的影 响 60-614.2.3TST05菌株感染对解毒酶的影响 61-624.2.4TST05菌株感染 对保护酶的影响 62-654.2.5TST05 菌株感染对乙酰胆碱酯酶的影响 65-664.3讨论 66-68第五章 TST05

17、菌株的生物学特性及菌粉制剂的制 备 68-775.1 材料与方法 68-705.1.1TST05 菌株孢子悬浮液 685.1.2 不 同培养基上 TST05 菌株菌落生长和产孢量的测定 68-695.1.3不同温度 条件下 TST05 菌株菌落生长和产孢量的测定 695.1.4不同湿度条件下 TST05 菌株菌落生长和产孢量的测定 695.1.5 不同温湿度条件下 TST05 菌株孢子萌发的测定 69-705.1.6TST05菌粉制剂的制备 705.1.7 菌粉制剂产孢量的测定 705.1.8 菌粉制剂胞外蛋白酶活性的测定 705.1.9数据分析 705.2结果与分析 70-755.2.1 不

18、同培养条件对 TST05 菌株菌落生长和产孢量的影响 70-725.2.1.1 不同培养基的影响 715.2.1.2温度的影响 71-725.2.1.3湿度的影响 725.2.2 温湿度对 TST05 菌株孢子萌发的影响 72-745.2.3两种培养容器对 TST05 菌株生长的影 响 74-755.3 讨论 75-77 第六章 TST05 菌株的野外应用研究 77-866.1 材料与方法 77-796.1.1TST05菌株的菌粉制剂 776.1.2菌粉防治桃小老 熟幼虫的 野外应用 77-786.1.3TST05 菌株野外宿 存研究 786.1.3.1TST05菌株在土壤中的数量动态测定 786.1.3.2宿存对产孢量 的影响测定 786.1.4TST05 菌株与七种化学杀虫剂的相容性研究 78-796.1.4.1杀虫剂的种类及来源 786.1.4.2杀虫剂对 TST05 菌株菌丝 生长的影响测定 78-796.1.4.3杀虫剂对 TST05 菌株孢子萌发的影响测 定 796.1.4.4 杀虫剂对 TST05 菌株孢子萌发生