PCR引物设计软件Oligo60的使用方法

1、PCR引物设计软件Oligo6.0的使用方法一、前言在当今分子生物学研究中，PCR技术已成为使用最多，最广泛的技术之一。而引物设计是PCR技术中至关重要的一环。在PCR扩增以前，一般模板序列已被全部或部分确定。要想扩增出理想的目的片断，一般都得通过正确设计PCR引物。也有的人不经过设计直接取模板序列的两个片断作为引物，这样很可能导致实验失败，如扩增出多条带（引发错配所致），不出目的带或出目的带很弱（引物引发效率低下），引物二聚体带（引物与引物之间形成稳定二聚体）等等。二、引物设计的原则引物设计有几条基本原则：首先引物要跟模板紧密结合，其次引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在，再次引物

2、不能在别的非目的位点引起DNA聚合反应(即错配)。围绕这几条基本原则，设计引物需要考虑诸多因素，如引物长度，产物长度，序列Tm值，G值，引物二聚体及发夹结构，错误引发位点，引物及产物GC含量，有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。以使用Oligo软件分析设计引物为例，大致有以下的要点：1. 引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74，即Taq酶的最适温度。2. 引物3端的序列要比5端重要。引物3端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高。另外引物间3端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败

3、。5端序列对PCR影响不大，因此常用来引进修饰位点或标记物。3. 引物的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。4. 引物所对应模板序列的Tm值最好在72左右。5. G值(自由能)反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的G值最好呈正弦曲线形状，即5端和中间G值较高，而3端G值相对较低，且不要超过9（G值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。6. 可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率高，错误引发的引发率一般不要高过100，如此可保证不出非目的产物的假带。7. 引物二

4、聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致PCR正常反应不能进行，与二聚体相关的一个参数是碱基的分布，3端的连续GGG或CCC会导致错误引发。8. 对引物的修饰一般是增加酶切位点，应参考载体的限制酶识别序列确定，常常对上下游引物修饰的序列选用不同限制酶的识别序列，以有利于以后的工作。但由于各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件较差，比如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；有时PCR产物要作为克隆对象插入到载体中表达，因此PCR引物设计的可选择度很低。遇到这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件，这时，使用自动搜索引物及正确

5、地评价引物可使研究人员对实验心中有数。三、引物的自动搜索和评价分析软件的引物设计功能主要体现在两个方面，首先是引物分析评价功能，该功能只有少数软件能够做到，其中以Oligo 软件最优秀；其次是引物的自动搜索功能，各种软件在这方面的侧重点不同，因此自动搜索的结果也不尽相同。、自动搜索功能以Premier 为最强且方便易用，Oligo软件其次。当然要想保证得到效果理想的引物，在自动搜索的基础上，还要对引物辅以人工分析，以得到最佳设计的引物。四、Oligo 6的使用图解1.功能简介在专门的引物设计软件中，Oligo是最大名鼎鼎的。Oligo 5.0的初始界面是两个图：Tm图和G图；Oligo 6.2

6、2的界面更复杂，出现三个图，加了个Frq图，。其实Oligo的主要功能集中在Analyze菜单里，只要把它弄懂了，其他的就很简单了。它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。Oligo 6.22比Oligo 5.0的改进有，多序列共用引物设计，排除出现频率高的序列片断，搜索功能更加强大细致，改观了界面等等。使用Oligo自动搜索引物也未尝不可，尤其是6.22版本，引物搜索功能得到大幅提高。2.使用方法（1）打开oligo的页面如下：（2）单击file菜单再点open或点击“打开”快捷图标或者用快捷键“CTrlO”可打开下面的窗口：（3）在打开的OPEN窗口内选择FreqSeq再点“打开”：（

7、4）选择drosfr或者其它一个文件点击“打开”：（5）出现以下窗口，点击“window”再点击“Tile”：图中显示的三个指标为Tm，G，Frq，其中Frq为6.22的新功能，为邻近6至7个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性。因为分析要涉及多个指标，起动窗口的cascade排列方式不太方便，可从windows菜单改为tili方式。如果觉得太拥挤，可去掉一个指标，如Frq，这样界面的结构同于Oligo 5.0，只是显示更清楚了。经过Windows/Tili项后的显示如图：在设计时，可依据图上三种指标的信息选取序列，如果觉得合适，可点击Tm图块上左

8、下角的Upper按钮，选好上游引物，此时该按钮变成，表示上游引物已选取好。下游引物的选取步骤基本同上，只是按钮变成Lower。G值反映了序列与模板的结合强度，最好引物的G值在5端和中间值比较高，而在3端相对低（如图）。Tm值曲线以选取72附近为佳，5到3的下降形状也有利于引物引发聚合反应。Frq曲线为“Oligo 6”新引进的一个指标，揭示了序列片段存在的重复机率大小。选取引物时，宜选用3端Frq值相对较低的片段：（6）再点击Search再点“For Primers and probes”或使用快捷键F3：（7）出现以下窗口，点“OK”就OK了。当然你也可以点击“Prameters”和“Sea

9、rch Range”选择你要的参数和你上下游引物的位置及你扩增产物的长度：（8）出现Search Status窗口，点“OK”： （9）出现Primer pairs窗口，#代表引物对的编号，依次为引物对所处的位置、产物的长度、最适合的退火温度、和GC的百分含量：（10）点击任一行出现“PCR”窗口，告知你扩增片断的位置，最合适的退火温度等等信息：（11）关掉“PCR窗口”和“primer Pairs窗口”回到原来的窗口你就能看到你引物的序列和位置，图中手型鼠标所指即为引物序列：（12）至此引物设计已经完成，可以用“Analyse”菜单分析你的引物：有无引物二聚体、发卡结构等等： 当上下游引物全选好以后，需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改。首先检查引物二聚体尤其是3端二聚体形成的可能性。需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之间形成。二聚体形成的能值越高，越不符合要求。一般的检测（非克隆）性PCR，对引物位置、产物大小要求较低，因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。第二项检查是发夹结构；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。一般来说，这两项结构的能值以不超过4.5为好。当然，在设计克隆目的的PCR引物时，引物两端一般都添加酶切位点，必然存在发夹结构，而且能值不会太低。这种PCR