伊贝沙坦对糖尿病大鼠肾氧化应激、ＮＦ-Ｂ活性和ＩＣＡＭ-１

1、伊贝沙坦对糖尿病大鼠肾氧化应激、-活性和- 表达的影响        【摘要】     【目的】 探讨伊贝沙坦对糖尿病大鼠肾脏氧化应激、-活性和- 表达水平的影响。 【方法】 将 只大鼠随机分为 组：正常对照组（）、糖尿病组（）和伊贝沙坦组（）。糖尿病大鼠模型用链脲佐菌素诱导。大鼠饲养周后，观察尿微量白蛋白排泄率（），取出肾脏作肾组织病理检查，测定肾组织中丙二醛（）含量与超氧化物歧化酶（）、过氧化氢酶（）、谷胱苷肽过氧化物酶（-）活性变化。逆转录-聚合酶链反应（-）

2、法检测肾组织中细胞间粘附因子-（-）的表达。凝胶电泳迁移率变动分析（）检测核因子（）-的活性。 【结果】 在组（ ± ）及组（ ± ）均显著高于组（ ± ）， ；组较组显著降低， 。与组大鼠比较，组大鼠肾组织含量显著增高（ ± ± ）， ；、及-活性均显著降低（ ± ， ± ， ± ± ， ± ，±）， ；组肾组织含量（ ±）明显低于组， ；、及-活性（ ± ， ± ， ± ）明显高于组，均 。-活性在组大鼠肾组织（ ± ）明显高于组（

3、 ± ）， ；组（±）明显低于组， 。组肾组织- 表达（ ± ）明显高于组（±）， ；组肾组织- （±）表达明显低于组， 。【结论】 伊贝沙坦可能部分通过减轻氧化应激反应以及下调糖尿病大鼠肾组织中-的活性，降低- 的表达水平实现对糖尿病大鼠肾脏的保护作用。     【关键词】  糖尿病肾病； 伊贝沙坦； 氧化应激； 核因子（）-； 细胞间粘附因子-     ， - ， - -， ， -， -， -， -， -（ ， ， - ， ， ）： 【】 ， - -

4、【】 - （） ： ： ； ： ； ： ， （） （） （）， （）， （-）， - （-） - - - （-） （） 【】 （ ± ） （ ± ） （ ± ）（ ）   （ ） ， （ ± ± ， ）； ， ， - （ ± ， ± ， ± ± ， ± ， ± ， ） （ ± ） （ ） ， ， - （ ± ， ± ， ± ， ） - （ ± ） 糖尿病肾病（ ， ）是糖尿病最常见的慢性并发症之一，严重影响患者生活质量和威胁患

5、者的生命，其发病机制尚未完全清楚。动物实验发现在链脲佐菌素（，）诱导的糖尿病大鼠中，血管紧张素系统和氧化应激参与了糖尿病肾脏病变的发病机制，糖尿病时高血糖使肾组织内血管紧张素（）增加，导致肾血管通透性增加，炎症细胞浸润；高血糖还可使活性氧（ ，）生成增加，损伤自身的抗氧化系统，参与的发生。是脂质过氧化的终产物，、及-是抗氧化的几项主要指标。研究认为，能激活核因子（）-，继而增强转录-等多种对肾组织有损伤的介质。有报道发现受体拮抗剂伊贝沙坦可抑制的增加，但是有关伊贝沙坦对-通路影响的信号转导研究相对较少。本实验旨在观察伊贝沙坦对糖尿病大鼠肾脏的保护作用并探讨其对糖尿病大鼠肾脏氧化应激反应和-活性

6、、- 表达水平的影响。  材料与方法  实验动物和试剂雄性-（）大鼠只（广东省动物实验中心提供），月龄，体质量 ，在恒温 、相对湿度 、昼夜周期 环境中适应性饲养周，自由觅食与饮水。（美国公司），（公司），（公司）， 聚合酶、 （上海生工），-基础试剂盒、上样缓冲液（公司），伊贝沙坦（法国赛诺菲公司），尿白蛋白试剂盒（法国 公司），丙二醛（）、超氧化物歧化酶（）、过氧化氢酶（）以及谷胱苷肽过氧化物酶（-） 试剂盒（南京建成生物工程研究所），试剂盒（美国公司）。 糖尿病大鼠模型的建立及分组糖尿病大鼠模型的制作： 溶液，按 腹腔注射， 后经尾静脉采血测血糖（ 血糖仪：美国公司）

7、。成模标准： 后测血糖空腹血糖 ，对照组予以腹腔注射等量枸橼酸缓冲液。糖尿病造模成功待血糖稳定一周后，大鼠按体质量分层随机分组，分为对照组（）、模型组（）、伊贝沙坦组（）。每组只。用药方案：均为强制性灌胃，伊贝沙坦组大鼠给予伊贝沙坦 （·）剂量，对照组与糖尿病组给予等量蒸馏水灌胃。所有大鼠在周实验期间均喂标准饮食，自由觅水，不应用胰岛素。  标本收集周末将全部大鼠置代谢笼收集 尿液保存，测尿白蛋白。所有大鼠禁食 后称量体质量，用戊巴比妥溶液 腹腔内注射麻醉，经腹主动脉采集血标本测血糖水平；处死大鼠，迅速灌洗后肾脏游离，取 大小肾组织，外固定，行染色。剩余肾组织速置于液氮中保

8、存，冻透后转入 冰箱中待测肾组织含量与、-活性变化，及测- 表达及-活性。  尿微量白蛋白排泄率（）测定 尿白蛋白水平（） × 尿量（），尿白蛋白测定采用放射免疫法。  肾组织含量与、-活性的测定用硫代巴比妥酸（）法，活性用黄嘌呤氧化酶法，活性用化学比色法，-活性用二硫代二硝基苯甲酸法。  肾组织病理形态检查采用-型图像分析系统对病理切片进行分析，在倍视野下随机选择皮质区个肾小球截面，检测肾小球截面平均直径（），根据体视学公式 计算出平均肾小球直径（），再根据公式（）计算出平均肾小球体积（ ，）。  -活性检测按照方法提取肾组织核蛋白： 取 肾

9、组织，加入溶液（） - 羟乙基哌嗪-乙烷磺酸（， ）、 ， ， 乙二胺四乙酸二钠（）， 二硫苏糖醇（）， 苯甲基磺酰氟（），美国公司，用研磨器研磨至匀浆状，冰浴，以离心半径 、 离心 ，弃上清，溶液洗涤，以离心半径 、 离心 ，弃上清。下层沉淀加入 预冷的溶液（）  （）、 、 、 、 、 ，甘油，冰上孵育 ，以离心半径 、 离心 ，取上清，即为核蛋白提取物。取少量用法测定提取物中蛋白浓度，剩余部分置于液氮中冻透后移至 冰箱中保存备用。凝胶电泳迁移率变动分析（）按照试剂盒说明书进行：将核蛋白提取液加入凝胶迁移结合缓冲液 -（ ）、 甘油、 、 、 、 ， 非特异性竞争（-）中预孵育

10、，加入- 标记的-一致性双链寡核苷酸探针，室温孵育 ，反应体系 。-一致性双链寡核苷酸序列： 。将形成的核蛋白复合物在 非变性聚丙烯酰胺凝胶中进行垂直电泳放射自显影 。用凝胶扫描系统进行定量分析。  - 检测试剂提取肾皮质总，取总产物进行-扩增反应。-引物序列：上游为-；下游为：-。内参照-引物序列：上游为- -，下游为- - 。反应条件： 预变性， 变性， 退火， 延伸，共循环。所有循环最后均 延伸 。产物在 琼脂糖凝胶（染色）上电泳检测，以为分子大小标记，在紫外灯下观察并照相，在图像分析系统上进行密度扫描。以-基因扩增产物的密度比较，表示-的表达水平。  统计学分析计量

11、数据以±表示，应用统计软件分析，组间差异性比较用检验及单因素方差分析， 表示差异有显著性意义。   结果  各组一般情况实验期间，正常对照组大鼠精神状态良好，无死亡；糖尿病造模成功后大鼠均出现多饮、多尿、多食、消瘦及生长行动迟缓等症状。其中，组有只死亡，组有只死亡，其中组只死于灌胃误伤，余死因不详。组及组血糖均明显高于组、体质量均低于组；组与组间血糖、体质量异无统计学意义。组及组均显著高于组；组较组显著降低（表）。   各组肾组织病理形态改变与组相比，组大鼠肾小球截面积、平均肾小球体积明显增大，组平均肾小球体积较组明显降低（图）。&#

12、160; 各组肾组织含量与、-活性组肾组织含量明显高于组，、及-活性明显低于组；组肾组织含量明显低于组，、及-活性明显高于组（表）。  各组肾组织-活性的改变组肾组织-活性明显高于组；组明显低于组（表）。半定量-结果显示，在 处可见清晰的-扩增条带，在 处可见内参照-的条带。组肾组织- 表达明显高于组；组肾组织- 表达明显低于组（图，表）。   讨论腹腔注射制备大鼠糖尿病动物模型的方法已被广泛采用。近年来，国内外基本认定糖尿病大鼠血糖值 作为糖尿病大鼠的成模标准。本实验中，用 按 腹腔注射， 后，出现多饮、多尿、多食等症状，测空腹血糖 ，病程中血糖始终在建模时的高

13、水平波动，未见转复，表明本实验中大鼠模型成立。本研究观察发现，与正常组大鼠比较，糖尿病组大鼠出现明显的肾小球内细胞数增多，平均肾小球体积增加，系膜基质增生明显，肾小球系膜区、基底膜区明显深染扩大；伴随尿微量白蛋白升高；伊贝沙坦治疗周后，肾组织形态学损害明显改善，包括肾小球内细胞数明显减少、平均肾小球体积增加程度减轻，毛细血管腔开放、炎症细胞浸润明显改善、肾小球基底膜增厚及系膜细胞增生明显减轻，同时增加的尿蛋白减少减轻，而血糖并无明显改变。表明伊贝沙坦能够阻止或延缓糖尿病大鼠肾脏的病理损害。糖尿病时肾组织中自由基代谢异常，高血糖及其代谢产物本身都是氧化剂，它们都消耗自由基清除剂；与葡萄糖接触时，

14、抗氧化酶本身的糖基化也会降低其生物活性，导致体内自由基大大增加，同时机体抗氧化防御能力下降，肾脏局部氧自由基的产生及清除失衡而使肾组织中增多，可直接引起生物膜脂质过氧化、细胞内蛋白及酶变性， 最后导致细胞死亡或凋亡、组织损伤和疾病发生。本实验结果发现糖尿病各组大鼠肾组织中含量高于正常组，、-活性均低于于正常组。经过治疗后，伊贝沙坦治疗组肾组织中含量低于糖尿病组，但仍高于正常组；伊贝沙坦治疗组肾组织中、-活性高于糖尿病组，但仍低于正常组。本研究结果提示氧化应激参与了糖尿病肾病的发病机制，而且伊贝沙坦对肾脏的保护作用与其抑制氧化应激反应有关。糖尿病状态下肾素-血管紧张素系统（）活性增高，尤其是肾组

15、织中含量增加，可促进的合成， 可通过激活丝裂原激活蛋白激酶（）信号传导通路，使核因子抑制蛋白（）磷酸化而被降解，使与-分离，激活-。-是一种具有多向性调节作用的转录因子，参与免疫、炎症等多种基因调控。近年来大量的研究表明，糖尿病患者处于炎症状态，血清- 活性升高。-与的发生、发展密切相关。等发现： 患者-表现出更高的结合活性，且其活性与蛋白尿程度相关，这说明-活性与及其程度密切相关。细胞间粘附分子-（ -，-）则是-调控的一个下游靶基因，可通过促进内皮细胞、系膜细胞与单核巨噬细胞、淋巴细胞黏附而参与的病理生理过程。等用-特异性抗体及间接免疫荧光法分析了链脲佐菌素（）诱导鼠-的表达，发现鼠肾小球

16、- 表达增强。本实验发现，与正常对照组相比，模型组大鼠肾组织中-的活性和- 的表达显著增强，伊贝沙坦干预组肾组织中-的活性和- 的表达明显低于未干预组。证明了糖尿病时肾组织内存在-的激活，进而导致-表达增加，这可能是的发病机制之一。而伊贝沙坦改善至少部分是通过抑制-通路降低-表达实现的。本研究结果发现，血管紧张素-型受体拮抗剂伊贝沙坦能减轻糖尿病大鼠肾脏损害的进展， 其机制可能与伊贝沙坦抑制糖尿病大鼠氧化应激反应和抑制-的活化，降低-表达有关。伊贝沙坦既能缓解血流动力学异常，又能缓解糖尿病肾组织内的炎症过程，为的研究提供了另一途径。    【参考文献】  1 ， （），（）：-2 ， ， ， - ，（）：-3 ， ， ， - （ ） ， ，（）：- 4， ， ， - ，（）：-5施新猷 医用实验动物学 西安：陕西科学技术出版社，：6马洪波， 张木勋， 路 群，等 糖尿病大鼠肾组织中-调控单核细胞趋化蛋白-表达作用的研究中华糖