PCR生物微流体芯片中的表面钝化技术

1、第11卷第4期2005年12月分析测试技术与仪器ANAL YSIS AND TESTIN G TECHNOLO GY AND INSTRUM EN TS Volume 11Number 4Dec. 2005综述(261268PCR 生物微流体芯片中的表面钝化技术章春笋1, 2, 徐进良1, 王汉平3, 王建琴4(1. 中国科学院广州能源研究所微能源系统实验室, 广东广州510640;2. 中国科学技术大学热科学和能源工程系, 安徽合肥230026;3. 广州市第一人民医院中心实验室, 广东广州510180; 4. 广州市第一人民医院医疗质控科, 广东广州510180摘要:聚合酶链式反应(pol

2、ymerase chain reaction , PCR 是一种重要的体外DNA 扩增技术, 在生物化学、分析化学以及分子生物学等领域中得到广泛的应用. 基于微电子机械系统(, M EMS 技术构建而成的PCR 生物微流体芯片由于具有反应速度快、. 然而, , . 本文结合本试验室的研究工作, 综述了PCR " , 主要包括表面钝化的必要性、静力学/PCR 抑制的机制等等. 关键词:聚合酶链式反应; 中图分类号:Q5, TQ31, 文献标识码:A文章编号:100623757(2005 0420261208(chain reactio n ,PCR 是利用耐高温DNA 聚合酶体外扩增D

3、NA 序列的技术, 该技术能使微量的核酸操作变得简单易行, 同时还可以使核酸研究脱离于活体生物, 它自1986年问世1以来已经在生物化学和分子生物学等领域得到广泛应用, 现已成为核酸分析和扩增的核心技术之一. 随着微电子机械系统(microelectro 2mechanical system , M EMS 技术的发展, 上个世纪90年代早期Nort hrup 2和Wilding 3等人就成功地在硅芯片上完成PCR 扩增反应. 由于硅微反应池具有较小的热容, 而且具有良好的导热性能、容易集成化, 所以它已成为PCR 生物微流体芯片的主要衬底材料. 但是, 未经表面处理过的裸露硅以及一些硅相关材

4、料对PCR 扩增反应起抑制作用4. 尽管玻璃是一种透明的、对PCR 生物兼容性较好的电绝缘导热材料, 但是当比表面积(surface 2to 2volume ratio , SVR 增大到一定程度时, 其内表面对PCR 反应也会产生不良影响. 况且, 用硅或玻璃衬底材料加工PCR 生物微流体芯片时通常要蒸空溅射或蒸发沉积技术在片基上镀上惰性金属作掩膜, 制作困难、技术复杂、步骤多、成本高.近年来, 为了寻求生物兼容性好、制作简单而且成本低的PCR 生物微流体芯片, 一些研究者已经在聚合物衬底材料上构建PCR 生物微流体芯片. 本文结合本试验室的研究工作, 以近5年来有关PCR 生物微流体芯片的

5、文献报道, 系统介绍PCR 生物微流体芯片中为了获得良好的PCR 体系而采取的表面钝化技术, 包括表面钝化的必要性、静力学/动力学表面钝化技术以及硅相关材料对PCR 抑制的机制等等.1PCR 微流体芯片简介PCR 生物微流体芯片主要有微池静态温度循环式和连续流动扩增式. 前者是通过M EMS 技术将PCR 反应体系微加工在芯片上的、以静态式反应器为基础, 各种反应都发生在限制性的有限空间里, 其中PCR 溶液温度在原位发生周期性的重复变化; 后者通常也是将PCR 微反应通道微加工在芯片上, 但收稿日期:2005208209; 修订日期:2005210224. 基金项目:国家自然科学基金资助项目

6、(No. 10272102作者简介:章春笋(1974- , 男, 博士研究生, 主要从事生物微电子机械系统以及生物微流体系统方面的研究. 其主要原理是动态式反应器, 样品和反应物通过连续流动经过3个不同的恒温带, 样品多次通过3个不同的温区, 从而达到DNA 片段高温变性、低温退火和中温延伸的热循环扩增的目的, 图1是PCR 微流体芯片图 .图1PCR 生物微流体芯片示意图Fig. 1Schematic of PCR bio 2microfluidical chip2PCR 生物微流体芯片表面钝化的必要性在PCR 生物微流体芯片中, 生物兼容性也许是最敏感最棘手的问题. PCR 微流体生物芯片

7、大部分是由硅、玻璃以及聚合物衬底材料微加工而成的, 早期的硅/玻璃PCR 生物微流体芯片的研究已经揭示了有关不利的表面相互作用3,4, 这种作用主要起源于下面两个因素:第一, PCR 反应是一个多成分的生物化学反应, 这些成分中至少有一种可能和PCR 微流体芯片中的微反应池或微通道的内表面发生一定程度的结合. 在某个需要扩增的DNA 样品存在的情况下, 几种必要成分如热稳定DNA 聚合酶、二价镁离子以及上下游引物的浓度通常需要维持在一个相当严格的范围内并彼此保持平衡, 以便产生一个优化的PCR 扩增反应; 第二, 在PCR 生物微流体芯片中,PCR 反应混合物常常受急剧增大的SV R 的支配,

8、 SV R 的相对增大增强了微反应池或微通道的内表面和反应混合物中各成分之间相互作用, 从而导致了内表面对PCR 反应的影响逐渐占主导地位. 另外, 靶标DNA 来源广泛, 与之相随的PCR 抑制剂的来源很广泛, 这些抑制剂的存在会干涉靶标DNA 扩增时聚合酶的活性6. 尽管一些新型的微流体芯片如介电电泳(dielect rop horesis , DEP 选择性过滤器7、鱼梁状硅微过滤器8,9以及DNA 固相萃取芯片10能够用来去除PCR 抑制剂,但是这些技术相对复杂, 还没有得到广泛应用. 还有,PCR 微加工过程所带来的物质以及在芯片制作PCR 扩增有抑制作用. 例如, Taylor 等

9、11微加工过程中所. 最近, Pan 2、商业上可用的塑料试可抛弃的注射器以及垫圈材料的生物兼容性, 认为表面的初始效应以及反复暴露于反应物中以及冲洗过程中的表面效应在PCR 生物微流体平台构建材料的特性全面评价中是很值得考虑的. 以上这些因素导致PCR 生物微流体芯片的设计和构造具有很大的复杂性. 然而, 有幸的是, 一些表面钝化技术已经被成功用来对PCR 生物微流体芯片进行表面钝化以获得良好的PCR 内表面.3PCR 生物微流体芯片中两种表面钝化技术3. 1静力学表面钝化技术在这种类型的钝化技术中, PCR 生物微流体芯片的内表面采用PCR “亲和”物质在PCR 生物微流体芯片微加工过程中

10、或者真正的PCR 化学反应之前进行预处理以达到表面钝化的目的. 这些“亲和”物质主要包括沉积的硅氧化物8,13,2128、牛血清白蛋白(bovine serum albu 2min , BSA 29,30、化学硅烷化试剂3137、环氧-聚N , N 2二甲基丙烯酰胺(epoxy 2polydimet hylac 2rylamide , EPDMA 38,39、聚丙烯衬垫(polyp ro 2pylene (PP liner 40、聚对二甲苯(Parylene 2C 4143等. 在大多数硅-玻璃杂交的PCR 微流体芯片中, SiO 2薄层被沉积来进行表面涂层以便改善PCR 生物兼容性, 而有时

11、这种表面涂层技术通过电子束蒸镀机也被用来沉积塑料基PCR 生262分析测试技术与仪器第11 卷物微流体芯片的内表面13. SiO 2表面涂层方法的一个明显优点是:钝化过程在芯片微加工过程中完成, 不会影响随后的微PCR 反应芯片通过阳极键合技术和玻璃盖片的密封3. 另外, 氧化物表面沉积是标准的工业化过程, 因而具有价格低廉、重复性好以及可在批量生产的环境下完成等特点4. 另外一种普遍采用的对PCR 生物微流体芯片内表面进行改性的静力学钝化技术是采用硅烷化试剂对内表面进行钝化, 它通常先用硅烷化试剂来填充微反应池或微通道, 然而将填充的微流体芯片培养一段时间, 接着驱除过量的硅烷化试剂, 最后

12、冲洗和干燥硅烷化的生物微流体芯片. 然而, 硅烷化过程消耗时间长、过程复杂、劳动强度大, 而且硅烷化后的生物微流体芯片也需要保存在液体中以保护硅烷薄膜免于损坏, 这对于实际应用是一个严重的问题14. 值得指出的是, 一些研究者通过对用于制作聚合物基表面达到一定程度18壁之间直接接触, 善PCR 反应的保真性, 使得硅反应池可以100%的重复使用1517. 需要指出的是, 当一种静力学表面钝化的“亲和”物质不能满足PCR 成功扩增需要时, 可以采用两种或两种以上的“亲和”物质来进行静力学表面钝化, 例如沉积的硅氧化物和聚四氟乙烯(Tef 2lon 44以及聚乙烯吡咯烷酮薄膜(聚四氟乙烯A P 薄

13、膜 和化学硅烷化试剂45. 3. 2动力学表面钝化技术动力学表面钝化技术发生于PCR 生物微流体芯片的样品填充和实际运行工作过程中, 通过在反应混合物中添加钝化试剂来完成. 在这种钝化技术的情况下, 最经常采用的钝化试剂包括竞争性蛋白BSA 辅佐剂19, 4652、聚合物溶液如聚乙二醇(polyet hylene glycol , PE G 12, 39, 50, 53、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone , PV P 39, 50、非离子表面活性剂Tween2045, 52甚至单壁碳纳米管(Sing 2walled carbon nanot ubes , SWCN Ts

14、 54. BSA 经常被添加到PCR 溶液中来稳定聚合酶, 减少蛋白质吸附到PCR 反应池的内表面. 一方面,BSA 添加到未被处理过的PCR 微反应池中会改善PCR 反应的保真性, 但是如果反应池表面被其它技术适当钝化后它的添加就显得没有必要; 另一方面, 如果PCR 反应池容积达到超微升甚至纳升量级, SV R 增加了1000多倍, 那么BSA 的动力学表面钝化也许证明是不够充分的39. 对于PE G 聚合物溶液, 具有不同分子量的PE G (如PE G400、PE G1000、PE G8000等 已经被分别添加到PCR 混合物中以便测试它们的添加对PCR 扩增的影响, 最好的结果通过添加

15、浓度为0. 75%(W /V 的PE G8000而被获取51. 在PCR 生物微流体芯片中这种相似的结果也被其他一些研究组所报道12,39,53. 至于PV P 聚合物溶液, 仅仅一定浓度的PV P 的添加也许对聚碳酸酯(polycarbonate , PC PCR 生物微流体芯片中PCR 50, 它往往需要5. 缓采用Tween20作完, 已经被发现在PCR 对PCR 扩增是很有效果的. 起作减少溶液表面张力的作用, 常常应用于蛋白质和核酸操作的领域中, 在保护蛋白质方面起到分散剂、乳化剂以及增溶剂等作用. 3. 3静力学/动力学复合表面钝化技术在这种表面钝化过程中, PCR 微流体芯片中的

16、微反应池/通道的内表面往往先通过静力学钝化技术进行预处理, 然后再通过动力学钝化技术对PCR 反应体系进行进一步的处理. 这种复合钝化技术能够克服单一表面钝化技术的不足, 但其过程复杂、代价较高, 表1列出了目前PCR 生物微流体芯片中的静力学/动力学复合表面钝化技术, 表2列出了PCR 生物微流体芯片中静力学钝化以及静力学/动力学复合钝化技术中经常采用的硅烷化试剂.4PCR 生物微流体芯片中硅相关材料对PCR 抑制的机制以及相应的钝化技术目前, 尽管几种聚合物材料已经成功地用于PCR 生物微流体芯片的制造中, 但大部分PCR 生物微流体芯片仍然是由硅材料制造而成, 硅反应池是由玻璃片覆盖而成

17、. 因此, 硅和玻璃材料仍然是PCR 生物微流体芯片制作的两种主要材料. 然而,在硅和玻璃的应用方面, 它们仍具有一些不尽人意的缺点, 尤其是PCR “亲和”性问题. 上述2种表面钝化技术自PCR 生物微流体芯片问世以来已经被广泛地采用来获得PCR “亲和”的内表面, 但是, 控362第4期章春笋, 等:PCR 生物微流体芯片中的表面钝化技术表1在PCR 生物微流体芯片中静力学/动力学复合表面钝化技术T able 1The Combination of static and dynamic surfacepassivation techniques in the PCR bio 2microf

18、luidical chips静力学/动力学复合表面钝化技术参考文献Chemical silanization +PV P (聚乙烯吡咯烷酮 +Tween 20(吐温205Deposition of silicon oxide +BSA (牛血清白蛋白5561Deposition of silicon oxide +BSA (牛血清白蛋白 (static +PV P (聚乙烯吡咯烷酮 62BSA (牛血清白蛋白 +BSA (牛血清白蛋白6366PV P (聚乙烯吡咯烷酮 +BSA (牛血清白蛋白 67Chemical silanization +BSA (牛血清白蛋白 68Chemical si

19、lanization +Tween 20(吐温2069Deposition of silicon oxide +chemical silanization +BSA (牛血清白蛋白 70Chemical silanization +BSA (牛血清白蛋白 +Tween 20(吐温20 71,72Chemical silanization +Acrylamide polymerization +BSA (牛血清白蛋白18,19,73表2在PCR 生物微流体芯片中常采用的硅烷化试剂T able 2Some silanizing agents used in the PCR bio 2microfl

20、uidical chips硅烷化试剂SigmaCote TM 34B TMSTFA355, 31, 32, ( 45, 69, 7139(氯二甲基八硅烷 Chlorotrimethylsilane (CTMS 32, 45, 70(三甲基氯硅烷 Hexamethyldisilazane (HMDS 32, 45, 73(六甲基二硅氮烷 Trichloropropylsilane (TCPS 32, 45(三氯丙基硅烷 Trimethoxymethylsilane 68(三甲氧基甲基硅烷 Dimethylformamide (DMF 36(二甲基甲酰胺 solution MPC with tri

21、methoxysilil group33as silane coupler制硅有关材料对PCR 抑制的潜在机制仍然不太清楚, 目前两种互补机制常常用来解释PCR 扩增的抑制效应:直接化学抑制和由于SV R 相对增大而导致的表面吸附抑制55. 最近, 几个研究组已经进一步研究在硅-玻璃PCR 生物微流体芯片的情况下所表现出的PCR 抑制机制以及相应的钝化技术32,44,45,55. Erill 等55通过系统地分析玻璃-硅PCR 生物微流体芯片中与材料相关的抑制和吸附现象, 认为硅相关材料对PCR 的抑制聚合酶在系统增大SV R , 而不是起, DNA 并没有明显地被吸. 这种发现具有重要的意义

22、, 它也许为今后PCR 生物微流体芯片中吸附效应进一步的研究提供有力的方向. 在高SV R 的SiO 2微装置中, Krishnan 等44也研究了微通道中PCR 反应具有非均匀性的问题, 发现沿着微通道所观察到的反应非均匀性也许与镁离子特异地吸附到具有负电荷的SiO 2表面有关, 而且在高SV R 微通道中高浓度的聚合酶往往需要来获得可比较的PCR 扩增效率. 这种采用较多的聚合酶来有效地补偿其表面吸附现象也被其它研究组所报道29,56,74. 在高SV R 的情况下聚合酶吸附效应也可以通过添加BSA 来抵消, 这是因为BSA 会和DNA 以及DNA 聚合酶竞争性地结合到SiO 2表面, 这

23、也是在相同的条件下BSA 和DNA 具有同性电荷的结果60. 然而,BSA 的浓度往往需要精确地优化, 因为高浓度的BSA 也许会比控制实验导致更低的扩增产物, 在很高的浓度下很有可能完全切断PCR 反应. 另外, Felbel 等32,45最近也系统地比较目前几种最常用的硅烷化试剂如DDM S , C TM S , HMDS 以及TCPS 对PCR 扩增效率的影响, 并通过润湿(即接触角 实验来研究化学表面改性的保护性表面薄膜的稳定性. 总而言之, 尽管在硅烷试剂静力学钝化方面可能出现不合意甚至自相矛盾的结果, 但是在硅、玻璃以及聚合物基PCR 生物微流体芯片中所表现出的抑制效应在以PCR

24、抑制机制为基础的广泛的方462分析测试技术与仪器第11卷法论指导下能被有效地克服. 5结论和展望自20世纪90年代初期PCR 生物微流体芯片问世以来, 其表面钝化技术就一直受许多研究者的注意. 从大的范围来看, 表面钝化技术主要有静力学表面钝化技术和动力学表面钝化技术, 当其中的一种表面钝化技术不能满足PCR 扩增要求的时候, 往往需要将两种表面钝化技术结合起来使用. 在静力学表面钝化技术中, 硅氧化物表面沉积和化学硅烷化是两种主要的静力学表面钝化技术, 这也许是由于硅氧化物沉积技术是标准的工业化过程以及硅烷化试剂可选性较强的缘故; 在动力学以及静力学/动力学复合的表面钝化技术中,BSA 是一

25、种最为常用的钝化试剂, 其次是聚合物溶液PEG 和非离子表面活性剂Tween20, 这是因为将一定浓度的BSA 添加到PCR 反应混合物中就能成功在PCR 芯片中完成DNA 扩增复制. 在片中, 扩增在微流. 参考文献:1Mullis K , Faloona F , Scharf S , et al . Specific enzy 2matic amplification of DNA in vitro :the polymerase chain reaction J .Cold Spring Harbor Symposia Quantitative Biology , 1986, 51:26

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