利用固定化耐高温木聚糖酶生产木二糖

1、生物工程食品科学2008, Vol. 29, No. 10365利用固定化耐高温木聚糖酶生产木二糖江正强，陈思思，李道义，朱运平，李里特（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京）摘要：将重组海栖热袍菌（）极耐热木聚糖酶固定于镍螯合环氧载体（固定化）上，水解玉米芯汽爆液连续生产低聚木糖，特别是木二糖。固定化操作稳定性很高，批次水解次仍保持的初始水解活性。下连续水解后保持的初始水解活性，连续操作半衰期为（）。分析表明，连续水解液中主要含有木二糖和木糖。活性碳层析柱可吸附木二糖，利用乙醇梯度洗脱木二糖的收率为，纯度为。因此，固定化可用于水解玉米芯汽爆液高效生产木二糖。关键词：活性碳层析；固定化；海

2、栖热袍菌；木聚糖酶；木二糖（），（，）：（），（），（）（）（），：；中图分类号：文献标识码：文章编号：（）木聚糖降解酶系主要有，木聚糖酶（）、，木糖苷酶（）等。木聚糖酶在食品行业的新应用主要为酶法生产功能性低聚木糖。低聚木糖亦称木寡糖，是由个木糖以，木糖苷键结合而成的低聚糖，部分还可能含有阿拉伯糖、葡萄糖醛酸等侧链，是新一代功能性低聚糖产品。木二糖具有独特的生理功能和良好的工艺性能，甜度约为蔗糖的，甜味清爽柔和，可用于食品、医药、保健品等领域，是低聚木糖的主要有效成分，也是低聚木糖的定性和定量成分。低聚木糖在我国、日本等已经工业化生产，木聚糖酶是生产低聚木糖的关键酶。一些木聚糖酶的水解产收稿

3、日期：物中以木二糖至木五糖（）为主，适合生产食品用低聚木糖。木二糖的制备可采用水解木聚糖或半纤维素，再经过分离纯化获得。水解方法有酸水解、高温裂解、酶水解等。酶法水解的木二糖得率高，水解进程容易控制。但大多数木聚糖酶水解木聚糖的效果不是很理想，主要因为水解产物中木二糖的比例低，后续分离困难。采用凝胶色谱柱法分离低聚木糖或制备少量高纯度的单一木二糖已有一些报道。凝胶柱层析所用柱料为聚丙烯酰胺凝胶和等，价格昂贵，且该技术处理量小、产品浓度低、操作要求高。也有采用吸附层析和生物发酵方法制备少量木二糖的报道，由于所用木聚糖酶特异性不理想、原料木聚糖成基金项目：“十一五”国家科技支撑计划重大项目（）；教

4、育部“新世纪优秀人才支持计划”项目（）366 2008, Vol. 29, No. 10食品科学生物工程本高、木二糖所占比例低和需要特异性酵母菌等原因，难以工业化应用。因此，安全、高效、适合工业化的木二糖生产方法亟待研究，关键之一是特异性木聚糖酶的研究。研究也发现大多数木聚糖酶水解产物中木二糖所占比例低（左右），少数木聚糖酶的水解产物中木二糖比例超过。等在用枯草芽孢杆菌高效表达源于一株芽孢杆菌的木聚糖酶基因，重组酶在水解木聚糖产物的分析表明木二糖所占比例达，表现出良好的工业化制备木二糖的前景。海栖热袍菌（）的极耐高温木聚糖酶基因（）经大肠杆菌表达所得重组木聚糖酶，水解木聚糖的产物中木二糖可高达

5、，在木二糖生产床高。连接蠕动泵和部分收集器，的柠檬酸缓冲液（）平衡。调节玉米芯汽爆液流速分别为、，酶解反应后取样。测定水解液中总糖和直接还原糖含量，用分析水解液中糖的组成。在夹套层析柱中加入湿态固定化酶，柱床实际高度为。下，汽爆液流速以连续反应，定时取样，采用法分析水解液糖组成以及测定流出液中还原糖含量，并计算连续操作的半衰期以评价固定化酶的连续水解操作稳定性。活性碳柱层析分离水解液制备木二糖将活性碳柱（，内装层析用活性碳）用去离子水以流速为平衡后备用。取连续水解试验收集的前样品，浓缩至左右上样。将含总糖为的浓缩液以流速上样，结束后开始洗脱（速度），去离子水水洗后，再用乙醇溶液（总体积）线性洗

6、脱，洗脱液用自动部分收集器收集（瓶），线性洗脱后采用乙醇溶液洗脱并收集。测定所收集的每瓶糖液的总糖含量，并检测糖组成。最后合并含单一木二糖组分的收集液于真空浓缩至过饱和糖浆状态，加入稍许木二糖晶种，室温静置等待结晶。分析方法直接还原糖含量测定采用法，以木糖为中具有很大的应用潜力。另外，与游离酶相比，固定化酶具有稳定性高，产物与酶分离回收容易，可多次重复使用，酶的利用效率高、可连续操作、工艺简便、生产成本低等一系列优点，成为现代酶工程领域的研究热点。国内外固定化木聚糖酶的研究报道有余篇，主要集中于固定化酶的性质、水解木聚糖和造纸方面的应用。迄今，尚未见到固定化耐高温木聚糖酶和采用固定化木聚糖酶用

7、于生产木二糖的研究报道。因此，本实验研究利用固定化耐高温木聚糖酶生产木二糖，以期找到一种高效率低成本的木二糖制备方法。材料与方法材料玉米芯粉山东龙力生物科技股份有限公司；层析用活性碳日本公司；（多孔丙烯酸微球，孔径）德国公司；其他试剂为国产分析纯。玉米芯汽爆液的制备称取玉米芯（含木聚糖），按：的固液标准。总糖测定采用法，以木糖为标准。总糖含量平均聚合度（值）直接还原糖含量薄层层析法（）：薄层板采用硅胶板；展层系统采用乙腈：水：（）。高效液相分析（）：采用型糖柱，柱温；流动相为超纯水，流速；采用示差检测器，检测温度。木二糖（晶体）质量木二糖（晶体）收得率（）×原料中木聚糖质量结果与分析

8、底物流速对固定化酶水解效果的影响玉米芯汽爆液流速对固定化水解效果的影响见图。流速在内，水解效率随流速加快而增加，但水解率在逐渐下降（图）。水解产物的组成有所变化但主要仍以木二糖为主，主要表现为木糖、木二糖含量减少，木三糖的含量逐渐增加（图）。可见，在高温下，固定化以很快的速度水解玉米芯汽爆液，产物以木二糖为主，适合于制备高木二糖含量的低聚木糖。降低流速，生产效率虽随之降低，但比加入蒸馏水，浸泡后加入高压罐中，加热在保温后打开球型阀，释放物料到收集罐中。抽滤收集的物料，滤液冷却至室温后测定其总糖及直接还原糖含量。用调节汽爆液至，冰箱冷藏备用。耐高温木聚糖酶的固定化酶液的制备和镍螯合环氧载体固定化

9、耐高温木聚糖酶的方法按参考文献进行。固定化耐高温木聚糖酶（简称固定化）的酶活力经测定为。固定化连续水解玉米芯汽爆液试验为了研究底物流速对固定化酶水解效果的影响，在内径的夹套层析柱中加入湿态固定化酶，柱生物工程食品科学2008, Vol. 29, No. 10367可以提高水解液中木二糖的比例，木二糖更容易分离纯化。所以，后续实验将采用较低的流速（），以提高木二糖的得率。总糖流速（）糖含量（）直接还原糖可在高温条件下水解，可以加快水解反应速度，提高生产效率。固定化酶水解玉米芯汽爆液的产物以木二糖为主，随时间延长，单糖与木二糖都呈下降趋势，木三糖则呈上升趋势（图）。合并并浓缩连续水解所得水解液。测

10、得其糖组分及比例为：阿拉伯糖：木糖：木二糖：木三糖：木四糖：木五糖：；木二糖所占比例为，单糖为，其他寡糖为（图）。固定化水解玉米芯汽爆液的水解液中木二糖的比例为。而利用水解桦木木聚糖，水解液中木二糖的比例达。其主要原因可能是玉米芯汽爆液本身存在少量单糖。另外，玉米芯木聚糖也含有阿拉伯糖基。因此，水解可能会产生含阿拉伯糖基的低聚木糖，不能被木聚糖酶进一步水解，从而降低了水解液中木二糖的纯度。使用纳滤或酵母发酵法不同流速水解中糖含量的变化。木糖阿拉伯糖木二糖木三糖木四糖木五糖除去水解液中的单糖后，木二糖的所占比例可达以上，尚不能达到结晶所需要的纯度。因此，后续实验将利用活性碳柱层析分离水解液以制备

11、木二糖晶体。阿拉伯糖；玉米芯汽爆液；为流速分别为、的水解液。不同流速水解中糖组成的、列、木糖至木五糖标准。图流速对固定化XynB水解效果的影响Fig.1 Effects of flow-rate of substrate on continuous hydrolysis ofAELC by immobilized XynB木三糖木四糖木五糖木糖至木五糖标准；图中下标数字为水解时间。木糖阿拉伯糖木二糖固定化连续水解玉米芯汽爆液固定化连续水解玉米芯汽爆液（流速下）的稳定性见图。由图可见，该固定化酶具有很好的操作稳定性，在连续水解后，相对水解率仍保持在。计算可得连续操作的半衰期为。另外，批次水解次仍

12、保持的初始水解活性。固定化木二糖木五糖木四糖木三糖还原糖（）木糖阿拉伯糖电压（）反应时间（）图固定化XynB连续水解玉米芯汽爆液的TLC（）和（）水解混合液的HPLC图Fig.3 TLC analysis of hydrolysates at different hydrolysis time (A)and HPLC of mixture of hydrolysates at different hydrolysis timewithin 40 h (B)反应时间（）反应在下进行，流速为。图固定化连续水解玉米芯汽爆液的稳定性Fig.2 Operational stability of cont

13、inuous hydrolysis of AELC byimmobilizedXynB368 2008, Vol. 29, No. 10活性碳柱层析分离水解液制备木二糖食品科学生物工程木糖。所以，可以活性碳柱层析高效制备木二糖，木二糖的回收率为，晶体的收得率达。因此，本研究的方法可高效生产高纯度的木二糖。结论活性碳层析分离酶解液的结果见图。以乙醇溶液线性洗脱能很好的发挥活性碳柱层析的分离效果，得到明显的两个峰，分别对应了水解液单糖（）和木二糖（）。收集所得总糖共计，总糖回收率为。含木二糖单一组分的收集液（瓶）中总糖为，木二糖的回收率为，占收集液中总糖的。分析纯度为。合并含木二糖单一组分的收集液

14、，浓缩结晶后，共得到晶体，晶体的收得率为（以玉米芯汽爆液中木聚糖计）。晶体熔点为，与资料报道值一致。经测定纯度为，且保留时间与标准品一致。镍螯合环氧载体固定化重组海栖热袍菌极耐热木聚糖酶（固定化）具有很好的稳定性，连续水解玉米芯汽爆液结合活性炭柱层析可高效制备木二糖。参考文献：，：，：，：李里特，艾志录，江正强橄榄绿链霉菌木聚糖酶水解玉米芯汽爆液生产低聚木糖食品科学，（）：张军华，勇强，徐勇，等分离低聚木糖的特性食品与发酵工业，（）：，：，：，：，：，：，：，：，（），：，：，：总糖（）瓶数（瓶）上样体积为，总糖，总糖含量为，直接还原糖，；流速；为收集的糖组分。图活性碳柱层析分离玉米芯汽爆液的固定化酶水解液洗脱曲线Fig.4 Activated charcoal column chromatography of hydrolysatesof AELC by immobilized XynB工业化生产中，固定化载体通常采用环氧载体。环氧载体性质非常稳定，长期运输、储存及酶与载体长时间反应，载体都表现出很高的稳定性。环氧基团能与酶分子中各种基团发生反应，如氨基、羧基、羟基等，所得固定化酶的性质非常稳定。固定化连续操作稳定性很高，批次水解次仍保持的初始水解活