地塞米松对多发性硬化细胞因子的影响

1、    地塞米松对多发性硬化细胞因子的影响        摘要目的：多发性硬化(MS)是一种由Th1细胞介导的自身免疫性疾病，因而减少T细胞产生-干扰素(IFN-)或增加白细胞介素-10(IL-10)的产生将会达到治疗MS 的目的。通过计数分泌细胞因子IFN-和IL-10，检测多发性硬化(MS)患者外周血单个核 细胞在地塞米松(Dex)影响下的IFN-和IL-10的分泌细胞水平。方法：将外周血单个核细胞暴露于中枢神经系统髓鞘素抗原髓鞘碱 性蛋白进行体外短时间培养，然后用Dex

2、作对比试验，用酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测 IL-10和IFN-分泌细胞，同时检测其它神经病组(OND)及健康对照组。结果：显示MS患者IFN-分泌细胞水平高于对照组，Dex使MS患者 IFN-分泌细胞减少，对IL-10分泌细胞无明显影响。结论：MS患者存在Th1/Th2细胞因子的失衡，Dex能抑制MS Th1类 细胞因子IFN-，恢复其两类细胞因子之间的平衡而对MS患者产生治疗作用。关键词多发性硬化地塞米松-干扰素白细胞介素-10 Effect of Dexamethone in vitro on immune functions in mult iple sclerosisZhu

3、 Shijin, Zhou Wenbin, Tang Xinnian, et alDepartment of Neurology, The first Hospital of Changde City, Hunan. 415003AbstractObjective：Multiple sclerosis (MS) is postulated to be a Th1- type cell-mediated autoimmune disease. Thus therapies that dectease Tcell interf eron (IFN)- production or increase

4、interleukin (IL)-10 production would be e xpected to have an ameliorating effect on MS. High doses of glucocorticoids (GCs ) are widely employed to treat acute attacks in MS patients. Their beneficial eff e cts are partially due to their capacity ot regulate the cytokine network. In th e present wor

5、k, we have examined the effect of GCs on the production of the immu nosuppressor cytokine IL-10 and the inflammatory cytokine IFN-. Methods: Blood samples from MS patients suffering an acute rel apse were obtained, Levels of IL-10 and IFN- secreting cells in PBMC were dete rmined by ILISPOT, The exp

6、ressions of IL-10 and IFN- were studied in blood MNC of the MS patients after being cultured in the presence of myelin basic protein (MBP), without antigen; in the presence of Dexamethsone, without drug.Results: In vitro experiments employing normal PBMC showed tha t Dexamethsone downregulated both

7、MBP induced-IFN- and spontaneous expression of IFN- no effect on IL-10 secreting cells was found. Conclusion: In summary, our results demonstrate a Th1-type cyt okine bias in peripheral blood mononuclear cells of untreated MS patients that i s reversed by Dex treatment. These findings provide a basi

8、s for immune monitorin g of patients with MS and suggest tha treaments downregulate IFN- may prove to be beneficial in progressive MS.Key words Multiple sclerosis Dexamethsone Interferon- Interleukin-10多发性硬化(MS)是一种由CD4+细胞介导的中枢神经系统(CNS)白质的自身免疫性 疾病，以CNS的炎性脱髓鞘和小血管旁单个核炎性细胞浸润为特征1，2。近年 来，对其发病机制研究进展较快，很多作者

9、认为CD4+细胞分泌的细胞因子在其发病中起 重要作用。CD4+细胞可产生两种细胞因子：即炎性细胞因子(Th1 cytoking, ck)，其可 以-干扰素(IFN-)为代表； 和调节因子(Th2)，其可以白细胞介素-10(IL-10)为代表。在正常情况下，Th1/Th2细胞因子互相拮抗处于相对平衡，机体处于免疫稳定状态。病 理情况时，二者平衡被打破，Th1细胞因子水平上升，Th2细胞因子水平下降，则导致细 胞 免疫介导的炎性疾病发生。通过免疫调节剂增强Th2 CK 的抑制作用或抑制炎性CK，来恢 复Th1和Th2之间的平衡似乎是一种可能的治疗途径3。可的松类药物是非常有效的免疫抑制剂，广泛的用

10、于治疗各种自身免疫性炎性疾病 4。地塞米松(Dex)用于治疗MS在急性期和预防复发方面都有明显的效果，但作用机 制尚不十分清楚。为了解Dex对IFN-和IL-10的影响，我们应用酶联免疫斑点试验(ELISP OT)的技术，从单个核细胞(MNC)水平，在自发和暴露于髓鞘抗原髓鞘碱性蛋白(MBP)刺激下，分别加用Dex和不用Dex进行实验，检测了MS患者外周血单个核细胞IFN-和IL-10分泌细胞。资料和方法临床资料MS患者组：21例均为湘雅医院1997年9月至1999年2月门诊及住院患者，其中男性8例，女性13例。临床诊断为MS5，年龄为1860岁，平均年龄39岁；病程为0.520年，平均10年

11、；9例患者无或仅留轻度功能缺损，其余有中度或严重的神经功能缺损。所有受试者在采取标本前6个月内均未使用包括激素在内的免疫抑制剂。其它神经病组(OND)：18例，其中男性8例，女性10例，年龄3870岁，平均年龄55岁。脑梗死2例，病毒性脑膜炎2例，肌紧张性头痛6例，多发性神经病3例，单发性神经病2例，面肌痉挛2例，三叉神经痛1例。健康对照组(HC)：12名身体健康的医院工作人员。标本处理：外周血(PB)，10ml加等量Iscovel培养液混匀后，经用淋巴细胞分层进行密度梯度离心分离MNC，再用Dulbeco培养液洗涤离心3次，用加有抗生素的FCS的Iscovel培养液悬，调整MNC至109/L

12、。抗原制备：MBP自牛脑髓鞘素中提取，经用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SPS-PAGE)纯化，显示相对分子质量为24万的单一条带6。IFN-分泌细胞检测：采用ELISPOT技术从单个核细胞水平检测IFN-分泌细胞。所有试剂盒为MABTECHAB公司生产(Sweden)，使用浓度度为15mg/L小鼠抗人IFN-单克隆抗体100l包被于96孔硝酸纤维膜微量板(Millititre,Bedford,MA.USA)4过夜，用碳酸缓冲生理盐水(PBS)，经0.45m直径滤膜滤过(下同)，洗板6次，每孔加入200l含有2×1055MNC，统计学分析采用Man-WhiteU检验。IL-10分

13、泌细胞检测，方法同上。结果1.Dex对自发性IFN-分泌细胞的影响，在MS组外周血中，自发性IFN-分泌细胞明显增多。Dex影响后IFN-分泌细胞明显减少，两者相比有显著性差异；OND和HC组上述条件下相比差异无显著意义(表1)。表1地塞米松对MS、OND及HC组外周血单个核细胞的IFN-分泌细胞数的影响(x±s分泌细胞数/105MNC)例数MBP0Ag0DrugDex0DrugDexMS2123.5±15.77.4±3.812.3±9.73.3±1.2OND183.2±2.73.7±2.82.1±1.92.3&#

14、177;2.7HC121.3±1.11.5±1.71.0±0.92.1±1.3P<0.001<0.010Ag无任何抗原条件下，0Drug无任何药物条件下，Dex地塞米松，P值为Dex组与0Drug组比较，下表同。2.Dex对抗原刺激下的IFN-分泌细胞的影响，在MS组PBL中，IFN-分泌细胞在MBP刺激下明显增加，在Dex影响后，同样刺激下IFN-分泌细胞增加明显减少，两者相比有高度显著差异，OND和HC组未发现明显差异(表1)。3.Dex对IL-10分泌细胞的影响，在所有MS、OND和HC组的PBL中发现有分IL-10泌细胞，在MS组无抗

15、原刺激下，Dex均能使IL-10分泌细胞增加，但与未加Dex条件下相比差异无显著性意义(表2)。表2地塞米松对MS、OND及HC组外周血单个核细胞IL-10细胞数的影响(x±s，分泌细胞数/105MNC)例数MBP0Ag0DrugDex0DrugDexMS214.2±6.845±3.519±3.822.2±4.6OND1828±3.527±5.724±3.321±6.9HC1227±1.922±2.423±2.125±6.5讨论MS患者病灶内发现有大量的炎性细胞浸润

16、，炎性细胞自循环进入病灶内的过程受到细胞因子的调节。对MS患者随访发现复发或恶化多在感染后发生，感染后的IFN-水平增高可能是诱发MS的主要因素之一7。IFN-属于Th1类细胞因子，参与免疫应答及炎性反应的诱导阶段，主要来源于活化的单核巨噬细胞。其可促进人类组织主要相容性抗原-(MHC-)在MS患者中枢神经系统(CNS)和周围血中单核巨噬细胞的表达、加强抗原的呈递、促进T细胞的活化、和上调粘附分子在血管内皮细胞的表达，总之，在启动MS发作中起到中心的作用。有作者观察到，在MS的急性期，IFN-的产生明显增加，肌注重组IFN-可加重MS的病情8。本研究结果也显示，MS患者IFN-分泌细胞高于0N

17、D组和正常对照组，表明循环中活化巨噬细胞与MS复发或急性发作有关。提示对抗IFN-的作用可能改善MS的病情5。本组对MS患者的IFN-分泌细胞进行对比检查发现，MS患者的IFN-分泌细胞受Dex的影响，Dex对MS的IFN-分泌细胞有抑制作用，特别是对抗原刺激下IFN-分泌细胞增多时有明显的抑制作用，所以临床上Dex治疗MS的急性期和复发时疗效明显，推测Dex可能是通过减少周围血IFN-的合成，抑制IFN-诱导的HLADR的表达，拮抗IFN-的免疫激活作用而达到对MS的保护作用。糖皮质激素可通过多种途径调节免疫功能。在MS，其能抑制T细胞的增殖及功能而产生抗炎的活性作用。固醇类药物可抑制促炎性

18、细胞因子IL-2、IFN-、TNF-和IL-1。另外，地塞米松可上调TGF-基因的表达，其为一种抗炎性细胞因子，可能在MS的缓解过程中起作用9。MS急性阶段的早期，血脑屏障(BBB)被破坏，活化淋巴细胞浸润进入CNS形成脱髓鞘病灶，此种现象可被对比-增强的磁共振(MRI)所观察到。而MRI发现，在MS的急性发作期使用固醇类药物可迅速减轻BBB的破坏。BBB的修复可能是通过下调粘附分子表达，从而减少淋巴细胞进入脑实质。固醇类药物尚可增强毛细血管内皮细胞的功能，因其能减少基质金属蛋白(MMP)及蛋白解酶的活性，后者能使血管基膜解体导致BBB破坏而使MS病灶形成10。糖皮质激素的免疫抑制作用还包括诱

19、导淋巴细胞凋亡、减少花生四烯酸产物的释放，进一步调节MS的炎性反应11。目前公认糖皮质激素可减少单核巨噬细胞的分化并抑制其功能。这种抑制功能可能是首先封闭了IFN-mRNA的表达和IFN-的分泌而实现的。当激素与胞质内特异性受体结合后，这些活化的激素-受体复合物被转运到细胞核内。在细胞核内，IFN-的合成在转录及转录后水平均受到抑制。激素-受体复合物可通过诱导IkBa抑制蛋白的合成而干扰转录因子NF-kB的活性，从而自动控制选择性的诱导IFN-mRNA的变性12。文献报道表明，其他Th1细胞因子如IFN-、IL-2、TNF-和IL-1等也可显著地受到固醇类药物抑制。对这些细胞因子合成的抑制也可

20、能发生在核转录水平，因为糖皮质激素能抑制NF-kB和AP-1的活性，淋巴因子基因诱导需要转录因子参与。另外，TNF-的活化过程依赖于金属蛋白酶的活化，如上所述，糖皮质激素中抑制金属蛋白酶的活性13。TNF-和IFN-一样，在MS的炎性病灶形成中起着关键性的作用。很久以来人们即观察到，治疗剂量的糖皮质激素使用可以使血中的中性粒细胞数量明显增加。这是因为糖皮质激素受体产生了调节和抑制血管内皮细胞表面粘附分子的转录及表达的作用，从而减少内皮对静止单个核淋巴细胞的粘附性，故循环中淋巴细胞增加。在MS，血管内皮的改变可增加BBB的通透性，容许淋巴细胞浸润进入CNS，在炎性病灶形成中起关键性作用。有作者报

21、道，在围绕MS炎性病灶周围的血管上有粘附分子的表达，且通过MRI研究表明，患者粘附分子水平的高低与病灶的演变有关14。本研究显示IFN-分泌细胞在MS患者中明显增高，而其已被证明为粘附分子的强烈诱导剂。因此，糖皮质激素作用于MS的另一个重要机制为调节内皮对炎性刺激的反应。这也可解释当糖皮质激素治疗MS时，增强-对比的MRI可观察到破坏了的BBB迅速得到修复。然而，淋巴细胞浸润进入CNS的被封闭不仅是因为粘附分子的下调，也可能是由于糖皮质激素干扰了基质金属蛋白酶的合成。IL-10主要由Th2细胞产生，可抑制抗原提呈细胞的功能及T细胞增殖，抑制Th1细胞分泌CK，可下调IL-1、IL-2、IFN-

22、、TNF-等炎性CK的产生和单核/巨噬细胞MHC类复合物的表达，单核/巨噬细胞产生细胞因子的作用亦被强烈抑制15，故IL-10为重要的免疫调节因子。有报道表明，IL-10与MS病情的缓解或复发有密切的关系，在其急性期，IL-10水平处于低值，而缓解期水平则上升16。Gayo等17报道，可的松类药物能促进Th1类CK向Th2类CK转化的倾向，可上调Th2类CK如IL-10、IL-4合成，与此同时抑制Th1类CK如IFN-的分泌。本组结果显示Dex可使IL-10分泌细胞轻度增加，但与对照相比无明显差异，说明Dex对IL-10分泌细胞无明影响。由此推测，Dex通过抑制IFN-而使Th1和Th2细胞之

23、间的平衡得到恢复，从而抑制炎症反应，促进髓鞘再生，BBB修复达到治疗目的。作者单位：朱世津（湖南省常德市第一人民医院神经内科415003）汤新年（湖南省常德市第一人民医院神经内科415003）周文斌（湖南医科大学附属湘雅医院神经内科）杨欢（湖南医科大学附属湘雅医院神经内科）肖波（湖南医科大学附属湘雅医院神经内科）谢光洁（湖南医科大学附属湘雅医院神经内科）参考文献1Ffrench-Constant D.Pathogenesis of multiple s clerosis. Lancet.1994;343271275.2Lublin FD, Reingold SC. Defining the c

24、linical course of multiple sclerosis:results of an international survey. Neurology.1996 ;46907911.3Beck J, Rondot P, Catinot L, et al. Increased production of interferon gamma and tumor necrosis factor precedes clinical mani festation in multiple scoerosis: Do cytokines trigger off exacerbations? Ac

25、ta Ne urol Scand 1988 78318323.4Imamua K,Suzumura A,Marunouchi T, et al. Cyto kine production by peripheral blood monocytes/macrophages in multiple sclerosis patients. Acta Neurol Scand 1993;87281285.5Poser CM, Paly UM.Scheinbre L. New diagnostic criteria for multiple sclersis guidelines for researc

26、h protocols. Ann Neurol.19 83;13227231.6Norton WT,Plduslo SE.Myelination in rat nerve ,method of Myelin isolation.J.Neurochem 1993;21749.7Griftths TD,Newman PK.Steroids in multiple sc lerosis. J Clin Pharm Ther 1994;19219222.8Roujeau JC. Pulse glucocorticoid therapy. The "big shot”revisited. Ar

27、ch Dermatol 19969Boumpas DT, Anastassiou ED,Older SA, et al. D examethasone inhibits human interleukin 2 but not interleukin 2 receptor gene ex pression in vitro at the level of nuclear transcription. J Clin Invest 1991;87 17391747.10Auphan N,Didonato JA,Rosette C,et al.Immunos uppressi

28、on of NFkB activity through induction of IkB synthesis. Science 1995;270 286290.11Yagi Y; Takahashi M;Nakamura Y.Cytokine-secr eting cells in relapsing multiple sclerosis patients treated with higy-dose intr avenous methylprednisolone. Rinsho Shinkeigaku, 1997;jul,377, 5759.12Comabella M;Balashov K; Issazadeh S; et al.E levted interleukin-12 in progressive multiple sclerosis correlates with disease activity and is normalized by pulse cycophosphamide therapy. J Clin Invest,