噬菌体随机肽库中与受损内皮细胞特异性结合短肽的筛选X

1、第29卷第6期南华大学学报医学版2001年12月噬菌体随机肽库中与受损内皮细胞特异性结合短肽的筛选郭玉1,王芳宇2,唐圣松1,廖端芳(1.南华大学药物药理研究所,湖南衡阳421001;2.南华大学生物化学教研室)摘要:目的筛选与受损内皮细胞特异性结合的短肽。方法以氧化型低密度脂蛋白(oxidizedlowdensitylipoprotein,ox-LDL)损伤牛胸主动脉内皮细胞,用丝状噬菌体(FUSE5)表面展示的随机6肽和15肽文库进行混合筛选,通过DNA序列测定确定其插入的氨基酸序列。结果经过3轮筛选,得到一些特异性结合的噬菌体克隆,随机挑选10个克隆,进行DNA序列分析,其中8个克隆含6

2、肽序列,2个克隆含15肽序列。结论用噬菌体技术能筛到与受损内皮细胞亲和力高、结合力强的特异性短肽。关键词:噬菌体多肽文库;生物淘选法;内皮细胞中图分类号:Q343.1文献标识码:A文章编号:1000-2510(2001)06-0535-04ScreeningthePeptidesSpecificallyBindingtheInjuredEndothelialCellwithTwoPhage-DisplayedRandomPeptideLibrariesGUOYu,WANGFang-yu,TANGSheng-song,LIAODuan-fang(TheInstituteofPharmacyand

3、Pharmacology,NanhuaUniversity,Hengyang,Hunan421001,China)Keywordsphage-displayedlibrary;micropanning;endothelialcell噬菌体多肽文库是利用噬菌体表面表达技术(phagedisplaytechniques,PDT)在体外条件下构建的多肽文库,将编码外源肽可变区DNA片段插入噬菌体基因组中,以融合形式与噬菌体的表面蛋白共同表达于噬菌体表面。外源蛋白基因为随机合成的寡核苷酸,具有多种多样的排列方式,其表达的氨基酸序列也是多种多样的,几乎可以包括自然界中任意一种短肽的排列方式。表达在噬菌体

4、外壳上的蛋白535特异性结合的短肽,以该短肽作为先导分子,经过进一步优化,可用于受损内皮细胞标志物9和治疗药物筛选研究。1材料与方法1.1材料噬菌体展示的FUSE5随机6肽及15;KanK91四环素抗性的F+大肠杆菌;胶原酶、胰酶为Sigma公司产品;饱和酚、乙醇等均为国产分析纯产品;PBS为2.5mmol/LKCl、140mmol/LNaCl、1.5mmol/LKH2PO4和6mmol/LNa2HPO4,pH7.4,高压灭菌;TBS为150mmol/LNaCl和50mmol/LTris,pH7.4;PEG/NaCl为20%PEG8000和2.5mol/LNaCl。1.2方法用0.1%胶原酶3

5、7消化20min。以小匙轻刮内膜,收集消化液,1000r/min离心5min。沉淀的细胞团加培养液制成悬液,计数,以2×104/cm种植于培养瓶,置二氧化碳培养箱中,24h后换液1次,待细胞基本融合后,用0.25%胰蛋白酶消化传代。第49代供实验使用。培养KanK91,37约36h后,挑一单克隆于2mLLB培养基中,37振荡培养过夜。取30L过夜菌至3mLTB培养基中,37剧烈振摇至OD600为1.252.5,减速振摇10min即为感受态细胞,须立即用作噬菌体的感染。L适当的稀释液与10L上述感受态细菌,室温静置20min,加入480LLB(含四环素Tc0.2g/mL),37缓慢振摇

6、3060min,诱导Tc抗性基因表达。取100L涂LB平板(含Tc2040g/mL),存的噬菌体展示文库,37缓慢振摇20min,倒入50mLLB(含Tc0.2g/mL)中,37剧烈振摇45min,添加Tc至20g/mL,37振荡过夜。离心(4,5536000r/min,10min),保存上清,再离心(4,10000r/min,10min),保存上清。加入0.15倍体积PEG/Na2Cl,混匀,冰浴4h以上,离心(4,10000r/min,30min),弃上清,再离心(4,10000r/min,1min),去尽上清。沉淀溶于2mLTBS中,加入0.15倍体积的内皮细胞融合成单层后,用ox-LD

7、L(终浓度为100g/mL)作用4h,镜下观察细胞间边界清楚,胞体变小,细胞收缩变圆,表明细胞明显损伤,以这样损伤的内皮细胞作为研究靶细胞。将40L噬菌体6肽及15肽文库(约1010TU/mL)与3mL含0.1%小牛血清的DMEM培养基混合,混合液与靶细胞于37温育1h。TBS洗涤除去未结合的噬菌体,甘氨酸-HCl洗脱液(pH2.2)洗下结合的噬菌体,立即用1mol/LTris-HCl(pH9.1)恢复洗脱液pH至7.0。洗下的噬菌体与正常内皮细胞37温育1h。沉淀噬菌体。沉淀溶于100LTE(pH8.0)中,加50LTris-HCl(pH8.0)平衡酚,振荡30s,室温放置1min。离心(4

8、,12000r/min,1min),取上层水相并加入250L乙醇和10L3mol/L乙酸钠(pH5.2)溶液,略加振荡,室温静置15min。离心(4,12000r/min,10min),回收噬菌体单链DNA沉淀,70%乙醇洗涤,离心,吸去上清,挥干乙醇,50LTE溶解沉淀,贮存于-20。序列,均由上海生物工程公司测序部测定,其测序引物为5-TGAATTTTCTGTATGAGG-3。噬菌体展示的FUSE5随机6肽及15肽文库含编码6肽和15肽DNA序列为:5-ACTCGGCCGACGGGGCT(NNK)6,15GGGGCCGCTGGGGCCG-3,其中N代表A、T、C、G4种碱基,K代表G、T2

9、种碱基,(NNK)6,15分别为编码随机6肽和15肽部分。2结果2.1细胞淘选效率(Efficiencyofcellpanning)细胞淘选应用于筛选细胞表面抗原特异性抗体,噬菌体文库中一些模拟内源性活性物质结构的多肽能与受损内皮细胞相应的受体(或分子)结合,经过3轮筛选,逐步淘汰非特异性及结合率低的短肽,得到的噬菌体克隆具有较高的特异性和较强的亲和力。淘选结果用每一轮筛选(Roundofscreening)获得每毫升噬菌体的感染单位(TU/mL)来表示。如图1所示。2.2DNA电泳分析第3轮洗脱液中随机挑选10个单克隆,扩增,提取单链DNA。经电泳分析,均可见到FUSE5的DNA条带(922

10、5bp或9252bp),证实提取的是FUSE5的DNA。见图2。2.3测序结果从第3轮洗脱的噬菌体中随机挑选并扩增了10个克隆,提取噬菌体的单链DNA,经测序确定插入序列。结果发现:8个克隆含6肽,2个克隆含15肽,且具有较好特异性。见图3及表1。图1三轮筛选结果图2DNA电泳分析1泳道:标准;2泳道:Kank91;39泳道:FUSE5图3测序图谱(下划线部分为插入多肽的互补序列)表110个克隆的插入序列插入序列6肽(8个克隆)氨基酸序列插入序列15肽(2个克隆)氨基酸序列5TGGTCGCGGCAGTATTCG35WSRQYS35TGGACGTCGGGTCCGTTTGGGCGTTCTAATTT

11、GCCTGGTCTTAGG35WTSGPFGRSNLPGLR33讨论血管内皮受损是心血管疾病的病理基础,是动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)的始动环节,ox-LDL是As最重要的致病因子,它首先作用于血管内皮细胞,使内皮功能障碍,分泌多种细胞因子和趋化因子,导致单核细胞粘附、聚集、内移、脂质沉积及泡沫细胞形成。噬菌体随机短肽文库中具有与某些细胞因子和粘附分子受体部分结构相似的短肽,它们与内皮细胞结合,拮抗相应因子和粘附分子活性,阻断537单核细胞与内皮细胞粘附,阻止As进程。PDT是筛选生物活性多肽的新方法10,筛到的短肽具有活性高、免疫副反应低、分子量小、合成费用低等优点。

12、我所在开展PDT技术与药物筛选研究中,已完成构建8肽文库1及确定单抗识别表位4等工作。在本所现有研究基础上,利用同一载体的两个肽库(6肽和15肽)来进行混合筛选,增加筛选的容量,便于得到相似的阳性结果。经过3轮筛选及测序分析,我们初步获得一个6肽和一个15肽序列,表明受损内皮细胞上与之相结合的受体或分子表达高、亲和力强,这些短肽的靶向性和生物活性有待进一步的研究。参考文献1刘革修,王华,张彤,等.噬菌体表面表达随机8肽4王芳宇,宋岚,何淑雅,等.噬菌体随机肽库在确定单抗识别表位中的应用J.南华大学学报医学版,2001,29(1):1-35吴晓琳,吴自荣,吕学洗,等.从噬菌体短肽库中筛选模拟乳腺

13、血清抗原表位J.上海免疫学杂志,1999,19(4):234-2366TangWG,GaoX,ChenFY,etal.PotentialGM-CSFantago2nistsselectedfrompeptidephagedisplaylibraryJ.ActaBio2chinicaetBiophysicaAainica,1999,31(4):463-4657李家大,王克夷.从噬菌体多肽文库中筛选-葡萄糖苷酶的抑制剂J.生物化学与生物物理学报,2001,33(5):513-5188KajiM,IkariM,HashiguchiS,etal.Peptidemimicsofmono2cytechem

14、oattractantprotein-1(MCP-1)withanantagonisticactivityJ.JBiochem,2001,129:577-5839MazzucchelliBL,BurrittJB,JesaitisAJ,etal.Cell-specificpeptidebindingbyhumanneutrophilsJ.Blood,1999,93(5):1738-174810BarryMA,DowerWJ,JohnstonSA.Towardcell-targetinggenetherapyvectors:selectionofcell-bindingpeptidefromran

15、dompeptide-presentingphagelibrariesJ.NatureMed,1996,2:299文库的构建J.中国病理生理杂志,2000,16(3):243-2462RodiDJ,MakowskiL.Phage-displaytechnologyfindinganee2dleinavastmolecularhaystackJ.CurrOpinBiotechnol,1999,10(1):87-93(收稿时间:2001-09-06)湖南医学更名启事湖南医学在广大读者、作者的关爱和兄弟杂志的支持下,走过了18年的历程。在新年之际,特向您们表示衷心的感谢。历年来湖南医学,曾获得“湖南省优秀科技期刊”“、湖南省一级期刊”“、全国优秀科技期刊”、“中国科技论文统计源期刊”。2001年又进入国家科技部(国科发财字2