地塞米松对HUVEC表达粘附分子的影响

1、    地塞米松对HUVEC表达粘附分子的影响        摘要研究地塞米松、rIL-1ra对内皮细胞表达粘附分子的影响，为炎症反应的病理过程提供理论依据。用rTNF、rIL-1和LPS诱导培养的人脐静脉内皮细胞（HUVEC），以地塞米松或rIL-1ra处理LPS或rIL-1诱导的HUVEC，采用Cell-ELISA法检测粘附分子ICMA-1和ELAM-1的表达。结果：rTNF、rIL-1和LPS提高HUVEC表达ICAM-1和ELAM-1；地塞米松、rIL-1ra抑制rI

2、L-1诱导的粘附分子表达。表明地塞米松、rIL-1ra以不同机制抑制HUVEC表达ICAM-1和ELAM-1。关键词地塞米松人脐静脉内皮细胞（HUVEC）细胞因子粘附分子中号R392.11 EFFECTS OF DEXAMETHASONE ON EXPRESSION OF ADHESION MOLECULES BY ACTIVATED HUVECZhang Qingyin，He Weijing，Hou Guihua，Liwei（Affiliated Hospital of Shandong Medical University，Jinan 250012）Abstract In order to

3、 study the effects of Dexamethasone and rIL-1ra on the expression of adhesion molecules by activated endothelial cells，and to provide evidence for pathologic course of inflammatory reactionCell-ELISA method was used to detect ICAM-1 and ELAM-1 expression on human umbilical vein cells（HUVEC） stimulat

4、ed with rTNF、IL-1 and LPSThe results showed rTNF、rIL-1 and LPS could induce the expression of ICAM-1 and ELAM-1 on HUVEC，whereas dexamethasone and rIL-1ra inhibited HUVEC to express ICAM-1 and ELAM-1 on HUVEC induced with rIL-1The findings indicate that Dexamethasone and rIL-1ra might inhibit the ex

5、pression of adhesion molecule ICAM-1 and ELAM-1 by different mechanism respectivelyKey words Dexamethasone，Human umbilical vein endothelial cells（HUVEC），Cytokine，Adhesion molecules炎症反应过程中，内皮细胞既可以作为细胞因子、炎性因子作用的靶细胞，又可分泌细胞因子、介导细胞粘附。中性粒细胞、淋巴细胞穿越内皮到达炎症部位杀菌消炎与皮细胞表达粘附分子有关1。细胞间粘附分子-1（Intercellularadhesionmo

6、lecule-1，ICAM-1）和内皮细胞白细胞粘附分子（Endothelialleukocyteadhesionmolecule-1，ELAM-1）均可在活化的血管内皮细胞膜上表达。某些研究结果表明，白细胞可通过其表面的配体与ICAM-1及VCAM-1相互作用，粘附于血管内皮细胞的表面2。本研究采用Cell-ELISA法检测了粘附分子的表达，探讨内皮细胞粘附分子的表达的影响因素。1材料和方法1.1材料脐带标本：健康产妇正常分娩后取新生儿脐带。标本取自山东医科大学附属医院妇产科。试剂：培养基RPMI1640培养液，GIBCO公司产品。内含青霉素100Uml，链霉素100gml，使用时加入20新

7、生牛血清。胰蛋白酶，Sigma公司产品，用RPMI1640培养液配成025浓度，rIL-1，10万Uml，rTNF 5万Uml，购于北京邦定生物医学公司。Anti-ICAM-1，12mgml，Anti-ELAM-1，18mgml，BritishBiotechnology（OxfordUK）产品，均为小鼠IgG1。rIL-1ra650gml，北京医科大学免疫学教研室马大龙教授惠赠。地塞米松5mgml，济南永宁制药公司。LPS，5mgml，为Sigma公司产品。1.2方法HUVEC原代培养：将正常分娩12h内的脐带，用pH72的PBS冲洗其静脉至肉眼无色为止，然后注入025胰蛋白酶，置37

8、6;C水浴1518min，收集脐静脉内消化液，再用20FCS的RPMI 1640培养液灌洗。离心后弃上清，以20FCS的RPMI1640制成细胞悬液，调整细胞密度分种于1明胶预包被的96孔板上，置37°C5CO2条件下培养。至形成致密单层后，去除培养上清，冲洗后的HUVEC单层用于ICAM-1和ELAM-1表达试验。粘附分子ICAM-和ELAM-1表达的诱导：在含有HUVEC单层的96孔板内，分别加入rTNF500Uml，rIL-1100Uml或LPS1gml诱导6h，测ICAM-1和ELAM-1的表达。采用rTNF500Uml，rIL-1100Uml，LPS1gml分别和地塞米松1

9、00nM同时作用HUVEC6h。加不同浓度的地塞米松与1gmlLPS诱导HUVEC6h。rIL-1（1gml）和rIL-1（1gml）地塞米松（10nM）诱导HUVEC6h，测ICAM-1和ELAM-1表达。rIL-1ra处理后的HUVEC，然后用rIL-1诱导。ICAM-1和ELAM-1抗原的检测3：细胞因子作用后的HUVEC单层，用pH72的PBS冲洗两遍，用1戊二醛4°C固定30min，用含005Tween20的PBS洗板3次，用3BSA封闭40min，200l孔，洗板后加入鼠抗人ICAM-1（04gml）或ELAM-1（06gml）单抗，50l孔，37°C置1h，洗

10、板3次后加HRP标记的羊抗鼠IgG100l孔，37°C1h，预温结束加TBM-H2O2 100 l，37°C显色15min，加2N H2SO4终止反应。450nm处读取光密度值。实验测定OD450刺激组OD450本底对照OD450。ICAM-1和ELAM-1表达以下列公式计算：统计学处理：采用t检验2结果2.1rTNF、rIL-1及LPS对HUVE表达ICAM-1和ELAM-1的影响选用rTNF500Uml，rIL-1100Uml，LPS1 gml诱导HUVEC单层6h，测ICAM-1和ELAM-1的表达。结果显示，3种诱导因子均可明显诱导2种粘附分子的表达，明显高于未刺激

11、的HUVEC（P005）。两种粘附分子的表达之间未见明显差异（P005），见1。1rTNF，rIL-1及LPS对HUVEC表达ICAM-1和ELAM-1的影响（n8）Fig1EffectsofrTNF，rIL-1andLPSonexpressionofICAM-1andELAM-1byHUVEC（n8）2.2地塞米松对rTNF、rIL-1和LPS诱导的HVUEC表达ELAM-1的影响采用rTNF500Uml，rIL-1 100Uml，LPS1gml，分别和地塞米松100nM同时作用HUVEC6h，刺激因子诱导的ELAM-1表达以百分对照表达的百分率表示，见2。结果显示，地塞米松明显抑制rIL-

12、1和LPS诱导的ELAM-1表达。100nM的地塞米松可使rIL-1诱导的ELAM-1表达下降60；使LPS诱导的ELAM-1表达降69；而对rTNF诱导的ELAM-1表达无影响。2地塞米松对rTNF，rIL-1和LPS诱导ELAM-1表达的影响（n8）Fig2EffectsofDexamethasoneonELAM-1expressioninducedbyrTNF，rIL-1andLPS（n8）2.3地塞米松抑制ICAM-1和ELAM-1表达的剂量依赖效应不同剂量的地塞米松，对1gmlLPS诱导的HUVEC表达ICAM-1和ELAM-1分子，表现不同的抑制作用，01nM的地塞米松即可表现明显

13、的抑制作用，当浓度增加至10nM时，抑制效应达最大值，见3。3地塞米松对LPS诱导的ICAM-1和ELAM-1表达的剂量依赖抑制效应（n5）Fig3Dose-dependentinhibitoryeffectsofDexamethasoneonexpressionofICAM-1andELAM-1inducedbyLPS（n5）2.4地塞米松对rIL-1诱导的ICAM-1和ELAM-1表达的抑制作用rIL-1（1gml）和rIL-1（1gml）地塞米松（10 nM）诱导HUVEC，测ICAM-1和ELAM-1表达。结果显示，rIL-1和rIL-1地塞米松处理后的ICAM-1和ELAM-1表达明

14、显高于单用地塞米松和未诱导组（P005）；rIL-1和rIL-1地塞米松处理后的ICAM-1和ELAM-1表达表现明显差异（P005），见4。4地塞米松对rIL-1诱导ICAM-1和ELAM-1表达的抑制作用（n8）Fig4InhibitoryeffectsofDexamethasoneontheexpressionofICAM-1andELAM-1（n8）2.5rIL-1ra对rIL-1诱导的HUVEC表达ELAM-1的抑制作用不同浓度的rIL-1ra加至HUVEC预处理10min，然后再加rIL-1 100Uml，6h后测ELAM-1的表达。实验表明10ngml和100ngml的rIL-1

15、ra不能抑制ELAM-1的表达，1000ngml时则表现明显的抑制效应，当rIL-1ra浓度增至10000ngml时，ELAM-1的表达降至56。LPS诱导的ELAM-1的表达则不能被rIL-1ra抑制,见表1。表1rIL-1ra对rIL-1诱导HUVEC表达ELAM-1的抑制作用Tab1InhibitoryeffectofrIL-1raonELAM-1expressionbyHUVECinducedwithrIL-1rIL-1raconcentration（×103ngml）controlexpression±srIL-1（100Uml）LPS（1gml）001102&#

16、177;28*96±5601105±71*106±391085±55*102±8110056±81*98±117100054±34*102±64*P005；?*P001comparedwithLPS3讨论在炎症组织中，白细胞与血管内皮细胞发生粘附是白细胞在血管内靠边和游走至血管壁外的前提，也是中性粒细胞损伤血管内皮的基础，在炎症过程中白细胞粘附穿越内皮往往与粘附分子的表达有关，在急性炎症反应的早期，内皮细胞表达ELAM-1分子，可以和中性粒细胞、淋巴细胞以及单核细胞表面的特异性配体结合，而内皮细胞ICAM

17、-1表达较晚，主要介导中性粒细胞及单核细胞的粘附1。内皮细胞粘附分子在白细胞迁移过程中的作用也有差异，ELAM-1在白细胞与血管内皮初粘附时起主要作用，ICAM-1与白细胞表面的CD11CD18配体结合辩认起始结合位点。单核细胞、中性粒细胞表面的P-selectin与ELAM-1结合，主要介导这些细胞沿内皮细胞表面滚动，然后白细胞受趋化因子的激活与ICAM-1发生强粘附，进一步促进白细胞穿越内皮2。糖皮质类固醇是一类应用广泛的有效的抗炎药物，其抗炎机理尚未完全明了。曾有报道地塞米松可减少前炎症细胞因子的合成5，抑制急性和慢性炎症反应中白细胞和内皮细胞的粘附6，抑制由细胞因子激活的粘附分子mRN

18、A基因转录7。我们对地塞米松调节HUVEC粘附分子ICAM-1和ELAM-1表达作了研究，结果表明地塞米松可明显抑制rIL-1和LPS诱导的ICAM-1和ELAM-1的表达。因此，地塞米松抑制白细胞进入炎症部位，可以通过抑制内皮细胞粘附分子的表达发挥作用。IL-1ra由于竞争性结合HUVEC表面的IL-1受体，而阻断IL-1的生物学效应。所以用IL-1ra预处理HUVEC后，rIL-1诱导的ELAM-1表达可被抑制。动物实验证明IL-1ra具有抗炎效应8。*山东省自然科学基金会青年科学基金资助项目（项目号：Q94C0717）作者单位：张庆殷何维敬李伟山东医科大学附属医院检验科济南 240012

19、候桂华山东医科大学基础医学院核医学教研室第一作者：男，33岁，硕士，主治医师参考文献1Pober TS， Cotran RCytokine and endothelial cell BiologyPhysiol Review，1990，704272 Oppenheimer-marks N，Davis LS，Bogue DT，et alDifferential utilization of ICAM-1 and VCAM-1 during the adhesion and transendothelial migration of human T lymphocytes，1991，147：291

20、33 Vanhee D，Delneste Y，Lassalle P，et alMadulation of endothelial cell adhesion molecule expression in a situation of chronic inflammatory stimulationCell Immunol，1994，155：4464 Frank Bennett C，Condon TP，Grimm S，et alInhibition of endothelial cell adhesion molecule expression with antisense oligonucleotidesJ Immunol，1994，152：35305 Kern JA，Lamb RJ，Reed JC，et alDexamethasone inhibition of interleukin-1（production by human monocyt