金属硫蛋白的研究进展

1、金属硫蛋白的研究进展蔡震峰 任凤莲(中南大学化学化工学院 , 湖南长沙 410083 摘 要 :金属硫蛋白 (MT是一类低分子量、高巯基含量 , 能大量结合重金属离子的蛋白质 , 因其功能独特 , 近年来对 MT 各方面的研究日益受到重视。本文对 MT 的性质、分类、 常用提取方法、分离纯化方法、检测方法以及功能作了逐一 综述。重点阐述了 MT 的检测方法 , 提出了有待研究解决的问 题 , 展望了其应用前景。关键词 :金属硫蛋白 ; 提取 ; 分离纯化 ; 检测中图分类号 :Q 51 文献标识码 :A 文章编号 : 1671 - 3206 (2007 02 - 0187 - 041957年,

2、美国科学家 Margoshoes 和 Vallee1在研究 金属生物学作用时,从动物器官中分离出一种新的蛋白质。 由于它是一种低分子量、高巯基含量,能大量结合重金属离 子,因此将该物质称为金属硫蛋白(metallothionein ,简 称 MT 。根据现有研究, MT 主要分为 MT-、 MT-、 MT- 和 MT-。 MT 分子呈椭圆形, 分两个结构域, 分子量为 6000 7000道尔顿,直径 3050A ,含有 61个氨基酸,其中 21个 氨基酸为半胱氨酸,这样每一个 MT 分子就可以结合 712个金属离子。人体、动物、植物以及微生物体内均含有 MT , 而且其理化特性基本一致, 具有

3、特殊的光吸收。 MT 构象较坚固,具有较强的耐热性。对于金属硫蛋白的研究,国内外主要集中在提取、检测 以及应用上。由于在实际生产中,主要采用层析法,分离纯 化后的金属硫蛋白中还含有其它的杂蛋白,因此本文作者正 在进行金属硫蛋白的分子印迹聚合物的研究,使其更好地应 用于金属硫蛋白的纯化。1 金属硫蛋白的理化性质一般来说, 哺乳动物的 MT 分子量为 60007000道尔顿, 但去金属后即硫蛋白分子量为 6000道尔顿左右,而真核微 生物的 MT 分子量范围较大,为 200010000道尔顿,如从 粗糙脉孢菌中分离出来的 MT 分子量为 2500道尔顿左右,酵 母菌中分离得到的 MT 分子量为 8

4、00010000道尔顿。高等 植物的 MT 的分子量为 1000013800道尔顿。 MT 的等电点 pI 一般在 4左右, 如哺乳动物 MT 的等电点在 3.94.6之间, 已发现的水生生物 MT 的等电点在 3.56.0之间。使各种金 属硫蛋白中 50%的金属离子发生解离的 pH 分别为 Zn-MT 3.54.5,Cd-MT 2.53.5,Cu-MT pH 1.0,但对植物中的 MT 来说,相应的 pH 要偏高些。 MT 的存在形式及稳定性与它 所结合金属的种类,是否结合了金属及环境的 pH 密切相关。 同样, MT 的光吸收特征除了与它的氨基酸组成有关外, 也与 它所结合的金属种类密切相

5、关 2。2 金属硫蛋白的分类及分布MT 的结构在生物进化中高度保守,有四种异构体, MT-和 MT-在大多数哺乳动物的内脏器官中广泛存在,尤以 肝、肾细胞为主,而且参加其功能调节。 MT-分布主要限 于中枢神经系统,主要分布于星性胶质细胞(集中于细胞体 和突起中 ,其次为神经元细胞,也有报道称少量分布于生 殖细胞、小肠、胃、肾和嗅觉皮质细胞中。 MT-主要分布 于皮肤、舌、消化道等器官的角质细胞和复层鳞状上皮细胞 中。3 金属硫蛋白的提取方法3.1主要试剂三羟甲基氨基甲烷(简称 Tris ; 5, 5-二硫二(2-硝基苯甲 酸 (简称 DTNB ; PBS 缓冲溶液。3.2 动物的处理参考 O

6、nsaka 等的方法 3,给家兔皮下注射 ZnSO44次, 第 1天注射 60mg/只 (约 15mg Zn/kg , 第 2、 4天注射 90mg/只,第 7天注射 120mg/只,第 8天处死动物取其内脏。 3.3 MT粗制品的制备1称重:将前一夜放 -4冰箱中解冻的试样拿出来用 托盘天平称重,试样重量 M ,精确到 0.1g ;2 搅碎:将试样用剪刀剪成碎片后, 用捣碎机捣约 30 50s ,捣成匀浆;3 提 取 :加 入 相 当 于 试 样 重 量 两 倍 体 积 的0.02MTris-HCl ,用磁力搅拌器搅约半分钟;4变性:加入等体积氯仿:乙醇(0.08:1变性除杂 蛋白,搅拌约

7、5分钟;5离心:5000rmp 、 4离心 25min ,弃沉淀,取上清;6热变性:75热变性 35min 除杂蛋白;7过滤:用冰块速冷后用 8层纱布过滤,取清液,静 置约 2h ;8离心:8000rmp 、 4离心 25min ,弃沉淀,取上清, 得到匀浆液。9层析、冻干:对匀浆液进行层析,然后收集富含 MT 的层析液进行冻干即得 MT 粗品。4 金属硫蛋白的纯化方法所谓纯化, 也就是 MT 粗品 (60%90% 、 MT 精品 ( 90% 以及纯品( 95%的形成过程。由报道的资料看,纯化方 法大概是一致的,首先是根据 MT-1和 MT-2所带电荷不同的 性质 4,进行离子交换将 MT-1

8、和 MT-2分开,然后将收集 MT-1和 MT-2的层析液分别进行脱盐, 最后收集冻干、 保存。 取匀浆液直接上 Sephadex G-50柱 (4.5×100cm 进行分离, 以 0.01mol/L Tris-HCl, pH8.6缓冲液洗脱。收集含 MT 组 分层析液,再上预先用 0.01mol/L Tris-HCl, pH8.6缓冲液 平衡好的 DEAE-Sepharose Fast Flow(3×70cm 柱进行离 子交换层析,以 Tris 缓冲液进行直线梯度洗脱(A 液:0.01mol/L Tris-HCl , pH8.6; B液:0.25mol/L Tris-HC

9、l , pH8.6 。分别收集含 MT-1和 MT-2组分,冷冻干燥浓缩成体 积 1520mL ,再分别上预先用 0.01mol/L碳酸铵平衡好的 Sephadex G-25柱(1.6×120cm 进行脱盐。所得 MT-1和 MT-2冷冻干燥后保存于 -20冰箱中 5。虽然文献中讲到许多分离纯化方法,但是多为实验室研 究,真正运用到实际生产的并不多,这主要与实际生产中的 各种环境因素的影响有关。在实验中发现,诱导后家兔肝脏 中 MT 的含量愈高,实际生产中 MT 的提取率就愈大,相反, MT 的提取率就愈低。5 金属硫蛋白的检测方法随着对 MT 研究的进一步深入,建立的 MT 检测方

10、法较多,但 所有这些方法都是建立在 MT 的理化特性和生物特性以及免 疫学特性基础上,主要分以下几大类。5.1 金属亲和分析法这类方法主要是基于 MT 对金属的高亲合力且不同金属的亲 和力具有差异性及其热稳定性而建立的。主要通过测定 MT 结合金属竞争性替换金属含量来检测 MT 中金属含量的增 高,从而计算出 MT 的含量。张保林等 6运用银饱和分析法 结合原子吸收光谱(AAS 检测了兔肝 Zn-MT ,具体方法为:向含 MT 的溶液中加入过量的 Ag+, 待反应完全后, 再逐次加 入血红蛋白,以结合剩余的 Ag+,加热使血红蛋白沉淀,与MT 结合的 Ag+则完全存在于上清液中, 通过 AAS

11、 测定其中 Ag+含量,便可计算出 MT 的浓度,该方法与其它方法比较,不 需要去除样品中共存的其它蛋白质和含 -SH 基剂,可直接计 算出 MT 含量,且不需要特殊的仪器设备,操作简便,具有 很高的重复性和准确性。金属亲合分析的缺陷在于,采用的 金属除与 MT 结合外,还与其它一些小分子量化合物结合, 由于利用金属含量间接推算 MT 含量,因此特异性较差 7。 5.2 电化学法此方法主要是利用巯基(-SH 在汞滴表面产生氧化还原出 现的电位变化建立的,以测定巯基来计算 MT 的含量,是一 种可以直接用于测定 MT 总量的方法,具有一定的特异性。 其检测限可达 ng/ml水平。运用检测 MT

12、的电化学方法有:示差脉冲极谱法(DPP 8、 微分脉冲极谱法 9、示差脉冲阳极溶出伏安法(DPASV 和 循环伏安法(CV 等。 Bordin 等通过改变检测体系的 pH 值, 利用 DPP 可以很方便地检测出样品中多种形式的 MT , 同时能 快捷地分析出还原型的 MT 。5.3 色谱分析法对 MT 中不同亚型的检测,色谱分析法较为适合,应用的色 谱分析法主要有 HPLC 、 RP-HPLC 、 HPLC-ICP-MS 、 HPLC-AAS 等,利用这类分析方法可以对 Zn-MT 的性质进行检测分析 10, 但此类方法需要有标准的 MT 样品进行对照。 Hunziker等 11使用 RP-H

13、PLC 从兔组织样品中可以分离出 7种亚型, 通过 AAS 来检测样品中的金属含量,可以对 MT 进行定量测 定。 Jin 等 12利用 HPLC 分离 MT ,然后根据样品对 250nm 紫外吸收特征来直接对 MT 定量,该方法的灵敏度小于 1g/mL。 由于常见的两种 MT 所带的电荷不同 , 与其它方法相比, 利用毛细管电泳法可以更好地分离纯化 MT-和 MT- 13。 5.4 蛋白质分析法 /免疫法此类方法主要是通过蛋白质含量测定来计算 MT 浓度,免疫 法是最主要的方法。它尤其适合于微量检测,具有灵敏、特 异的特点, 灵敏度在 pg/ml级, 对存在体液中含量甚微的 MT 具有较好的

14、检测效果。在近些年,先后建立了 Western Blotting 法、放射性免疫检测法(RIA 和酶联免疫吸附法 (ELISA 。RIA 法首先由 Mallie 等在 1979年检测大鼠血清中 MT 的 含量时建立的,随后 Mulder 等建立了测定人体液中 MT 含量 的 RIA , Zahir Shaidh A等报道了用 RIA 检测镉污染地区人 群的尿液 MT 含量 14。 此方法的检测范围在 0.1100ng/ml之间, 但是此方法要用放射性同位素, 需要 3天左右的时间, 给检测带来不便。1986年 Thomas 等建立了 ELISA 法,与 RIA 法无显著差 异,灵敏度可达 10

15、0pg/ml,与 RIA 相比具有测定相对迅速, 且不需昂贵的仪器设备和接触放射性同位素。 Akintola 等在1995年利用 MT-1制备抗体建立了 ELISA 测定人血浆和尿液 中的 MT 含量,检测限可达 5ng/ml。郑军恒等 15在检测人 血液中的 MT 过程中建立了 2种 ELISA 方法,直接型 ELISA 的检测范围为 110ng , 可用于检测较纯样品, 竞争性 ELISA 较好的检测范围是 50500ng , 用于检测较粗的样品中 MT 的 含量。5.5 光谱法采用液相色谱(LC 和紫外(UV 相结合检测确定家兔 肝脏中分离脱金属硫蛋白的最佳条件, 同时, 利用 LC-E

16、S-MS 可以确定家兔肝脏中不同结构的脱金属硫蛋白,主要对 MT-和 MT-的结构及其同分异构体进行了研究 16。由于目前金属硫蛋白的测定主要采用紫外 -可见分光光度法 以及原子吸收光谱法测定其中的金属离子。前一种方法灵敏 度较低,由于检测取样少,检测过程中造成的误差较大,后 一种方法却因为分离纯化过程中可能有部分金属脱离蛋白 造成损失引起误差,且测定费用昂贵 17。针对这种情况, 建立了镉金属硫蛋白的非原子化测定方法,检出限与石墨炉 法(GFAAS 相近 18。5.6 MT克隆及 MT-mRNA 检测随着分子生物学技术的快速发展, 使 MT 克隆技术、 RNA 印迹 技术和 PCR 技术应用

17、于 MT 的定量检测成为现实。 MT 克隆检 测是通过 MT 多克隆和单克隆抗体,运用免疫扩散、免疫电泳等方法来检测组织中的 MT-mRNA 含量进行定量分析,这在 MT 分子的生物学研究中有很重要的意义。MT 多采用联机检测, 虽然以免疫法最为可靠, 但是检测过程 复杂,时间消耗大,联机检测大大节省了时间,同时可以减 少检测过程中产生的误差。 MT 在逐步产业化, 然而目前还缺 乏一种简便、 灵敏、 快捷适宜产业化的分离纯化和检测技术, 这也成为 MT 研究的热点。6 MT的功能对于 MT 的功能, Vallee19从基因调节、大脑的神经 元生长抑制以及与谷胱甘肽的相互作用三方面做了详细介

18、绍。随着对 MT 的不断深入研究,报道出的功能也开始多面 化,国内关于 MT 功能方面的综述报道很多 2, 20,其主要 作用有:清除体内自由基、防止机体衰老;解除重金属的毒 性;参与体内微量元素的代谢;增强机体对各种不良状态的 适应能力;锌元素的贮存库;防止细胞癌变等。7 结语金属硫蛋白的研究已经近半个世纪,对 MT 的结构和生理学 功能研究取得了许多成就,而且对于 MT 与一些疾病的关系 研究也取得了许多重要成果。但是仍有一些问题需要进一步 的探讨和研究。譬如 MT 在分离纯化时,需要进一步改进工 艺,提高提取率,更适合工业化生产;尚没有一个 MT 的标 准检测方法; MT 在体内的代谢途

19、径仍未探明 ; MT在体内浓度的影响因素以及在疾病方面发生的机理还需要进一步研 究; MT 的基因结构及调控还有待深入研究。总之, MT 具有很大的开发潜力和无法估量的应用价值, 随着 人们对 MT 研究的不断深入,对 MT 作用机理的不断探明, MT 的应用也将越来越广泛。参考文献1Margoshoes M and Vallee BL. A cadmium protein from equine kidney cortexJ.Am Chem Soc 1957,79:4813-4814. 2刘安玲,朱必凤 . 金属硫蛋白的研究进展 J.韶关学院学 报(自然科学版 , 2001, 22(3 :8

20、6-91.3Onsaka S. Cherian M. G. The induced synthesis of metallothionein in various tissues of rats in response to metals : influence of zinc status and specific effect on pancreatic metallothioneinJ. Toxicol, 1982, 23(1: 11.4张亨山, 赵金垣, 陈晓龙, 等 . 金属硫蛋白的提纯 J. 大 同医学专科学校学报, 1999, 19(4 :4-8.5潘爱华,茹炳根,李令媛,等 . 锌诱导家兔肝脏金属硫 蛋白的纯化及鉴定 J. 生物化学与生物物理学报, 1992, 24(6 :509-514.6张保林，盛湘溶，刘兴军，等.金属硫蛋白测定方法 银饱和分析法J.药物生物技术，1996，3（1） ：31-33. 7王达，葛刚，吴兰，等.金属硫蛋白（MT）的分离纯化和 检测技术J.江西科学，2004，22（1） ：61-65. 8Olafson R W, Sim R G. An electroc