{超薄切片中的细胞和病毒}

1、chapter 超薄切片中的细胞和病毒，正常与病理细胞的比较  ，病毒在细胞中的生活周期  ，病原病毒的鉴定在病毒的整个生命周期中，一定需要宿主细胞提供其复制核酸、合成蛋白和组装的场所，而且病毒并没有完整的酶系统,它需要利用宿主细胞的一系列“装置”为其服务。这些都可导致宿主细胞发生病变。电镜是观察细胞及亚细胞结构的重要手段。目前，我们所获得的关于细胞、细胞器，甚至一些细胞内大分子的形态信息大多都由它来提供。本章将着重讲述利用超薄切片技术结合其它辅助方法，在电镜下观察病毒与宿主细胞的相互作用及其病毒生命周期，并简单介绍利用超薄切片和电镜进行病原病毒的鉴定和检测。section

2、正常与病理细胞的比较电镜下观察到的原核细胞结构相对简单，膜系统不发达。在电镜下观察原核细胞多使用负染色技术，主要关注于它的大小，形态（杆状、球状等），鞭毛或菌毛的着生位置、数量等。正常的原核细胞，尤其是处于生命活动旺盛的分裂期的细胞，常可看到细胞由完整流畅的内、外膜包围，有些细胞内还可看到一些细胞器（图 图1）和细胞内膜状结构等。病毒（噬菌体）入侵这些原核生物时，有时可导致原核细胞膜变得皱缩，呈波浪形，不再光滑(图图2)，有些可观察到细胞内子代病毒。真核细胞结构比较复杂，表面细胞膜有多种分化，细胞内部还有丰富的细胞器，如细胞核、内质网、高尔基复合体、线粒体、质体、溶酶体、核糖体、微管微丝及脂肪

3、滴、糖原等。不同的病毒感染，所引起的病变也不尽相同。其中细胞核、线粒体、内质网等的变化尤为明显。subsection细胞膜和细胞的表面分化及其病毒对其的影响细胞膜主要由蛋白质，类脂（胆固醇、磷脂）、糖类（糖蛋白、糖脂）构成。细胞膜的一切功能就是在液态的脂类双分子层和蛋白质结构基础上进行的。镶嵌在膜中的蛋白质执行许多重要的功能，如主动运输膜内外物质的转运蛋白，接受激素、神经递质以及一些药物信号的受体、许多酶及特异性的抗原等都是镶嵌蛋白质。植物细胞的质膜外，尚有层纤维素构成的细胞壁，而动物细胞在其原生质外，仅有一层薄的质膜（即细胞膜）。随着组织化学及电镜技术的进展，有人认为，除了在细胞结合很紧密的

4、部分外，所有的细胞膜均覆有一层粘多糖的细胞被（cell coat），一般动物的细胞被在电镜下呈绒毛状或细丝状，其厚度为15nm。根据膜结构的现代概念，在多数细胞中，细胞被无论在结构上或功能上均为完整的细胞膜组成部分，而不是外加在细胞表面的附着物，它主要的成份是糖蛋白和糖脂。细胞被具有多种功能。它除作为细胞膜的保护层外，与免疫作用有关的膜抗原（包括血型抗原和组织相容性抗原等）、各种特异性受体、一些与细胞表面活动有关的酶类等，都存在于细胞被中。此外，在某些组织中，细胞被起着滤器的作用，或者给细胞创造一种特殊的微环境。生物体内的各种器官和组织中，有些细胞的细胞膜区域由于与吸收、分泌、液体输送以及其它

5、的生理功能，而使它的形态发生改变。这些形态发生改变的区域，即细胞的表面分化，位于细胞的游离端或在细胞的基部，也可以在细胞相邻之间的连接处。主要的细胞表面分化包括微绒毛、纤毛、细胞连接等。微绒毛是上皮细胞顶部的细胞质突起，呈圆柱状。在超薄切片中，根据切割面的不同，呈现不同的形态。微绒毛横切面，为整齐排列的圆圈状，经过四氧化锇固定后黑色的边界为细胞质膜，而微绒毛的纵切面，呈现为向外突起的长条状。还有一些是微绒毛的斜切面，表现为椭圆状。纤毛是细胞质表面突出形成的表面结构。其外有细胞膜包围，内为细胞质，其中有纵行的微管。纤毛细胞膜内有9组成对的二联微管围成一圈，中间为两根单独的微管，呈9+2结构。而纤

6、毛的斜切面或纵切面并不表现为这种典型的9+2结构，而可能只有细胞膜包裹的染色较深的长带状。纤毛的主要功能是运动。高等有机体的组织是由无数细胞构成。这些细胞已失去了某些独立性，而作为一个整体进行活动。为了统一行动和促进细胞之间必需的相互联系，细胞表面区域已经特化，以便进行接触。这些细胞表面的特化，称为细胞间连接（intercellular junction）。它对高等生物的发育和正常功能是不可缺少的。病毒入侵可导致细胞膜及其表面分化发生变化。在病毒入侵初期，病毒主要依靠识别细胞膜上的受体分子，结合上去，继而改变细胞膜的结构，如病毒本身囊膜与细胞膜融合；或导致细胞膜内陷，使细胞吞噬病毒等。在病毒复

7、制、成熟过程中，病毒也可导致细胞膜发生变化，如引起细胞膜与相邻细胞膜发生融合，这在黄病毒属等病毒中是比较常见的现象；病毒在成熟后的释放，可引起细胞膜发生出芽、或者细胞膜破裂等现象，从而释放成熟的病毒粒子。还有的病毒在入侵宿主细胞过程中可导致细胞膜表面形成病毒抗原层。病毒抗原层是一种厚约4nm的均质性电子致密的结构。覆盖在细胞膜表面，与质膜有明显的界限（图 图3）。有时这些成分会大量增生，从而在感染的细胞表面形成盘曲的结构，这些结构还能形成近似病毒轮廓的结构（图 图4）。subsection病毒引起的线粒体的变化subsubsection正常细胞的线粒体正常线粒体（mitochondrion）具

8、有双层单位膜结构，是进行生物氧化及提供生命活动所需能量的重要细胞器，普遍存在于真核生物的所有细胞中。线粒体在细胞内的数量因不同细胞而有很大的差别。一般生理功能活跃的细胞中数量特别多；而生理功能不甚活跃的细胞中，则较少。线粒体外膜包裹在整个线粒体外面，内膜向线粒体内突起形成许多折叠，称为线粒体嵴（christae mitochondriales）。外膜与内膜之间的间隙称为膜间隙或外室，此区电子密度很低，故浅亮。线粒体嵴与嵴之间的间隙称为内室。由于里面充满基质，故又称基质间隙，此区呈中等电子密度，基质（mitochondrial matrix）内有一些直径3050nm的电子的密度高的基质颗粒，颗粒

9、内含有钙离子、镁离子等二价阳离子。嵴内面的间隙称嵴内间隙，它与外室相连(图图5)。不同种类的的细胞线粒体形态上有较大差异，主要表现在线粒体整体的大小、形态，嵴的数量、形态和排列上。在大多数情况下，线粒体呈圆球状或棒状。典型的圆球状线粒体可在肝细胞中找到，其直径为0.5-5m。而棒状的线粒体直径多为0.2m以上，长可达20m。分支状的线粒体、轮状线粒体、碟状线粒体和杯状线粒体也有报道。大部分细胞线粒体的嵴呈薄板状。嵴的排列方向与线粒体长轴垂直，但也有斜方向或甚至接近于纵行排列的嵴。有一些细胞，如肾上腺皮质细胞等的线粒体嵴大多为弯曲的小管状，其切面呈小泡状和管状。一般氧化代谢率高的细胞中，线粒体的

10、嵴比较多，基质较少，而在代谢率低的细胞或一些植物细胞中，线粒体的嵴短而疏。线粒体是细胞内生物氧化的主要场所。线粒体的外膜、内膜、嵴、外室及内室中都含有很多种酶类，其中大多数是和生物氧化有关的。三羧酸循环、呼吸链电子传递及氧化磷酸化都在线粒体内进行。三羧酸循环是在线粒体的内室基质中进行的，而氧化磷酸化过程是在线粒体内膜上进行的。一般认为，位于内膜上的基粒头部相当于ATP合成酶，是将释放的能量转给ADP生成ATP的部分，与氧化和磷酸化的偶联过程有关；基部含有整套与电子传递过程有关的酶类。subsubsection病毒引起的线粒体病变病毒感染宿主细胞后，常见线粒体发生嵴内肿胀，基质变稠，成电子密度致

11、密带(图图6)，有些基质呈致密板状绕于线粒体周边(图图7 )，还有一些嵴消失，线粒体成小泡，严重时线粒体膜破碎(图图8 )。有些病毒感染宿主细胞后，可引起线粒体膜内陷，形成小泡状结构(图图9 )，研究表明这些结构与病毒核酸的复制、蛋白合成等有关。很多病毒在形成过程中都会形成一定的病毒发生基质，病毒的核酸复制，蛋白合成及其子代病毒粒子的组装等过程都在这个区域完成，这些步骤的完成往往需要大量的能量、物质运输等，所以病毒引起宿主细胞内线粒体的变化还经常可引起包括在粒体数量以及分布等方面的变化(图图10 )。subsection病毒引起的内质网结构的变化 内质网（endoplasmic reticul

12、um，ER）是由单位膜构成的一种重要细胞器，它广泛存在于各种细胞内，其形态和数量随各细胞而异。在有些细胞（如各种类型的白细胞）中很简单，只有少数小泡、小管状；而在另一些细胞（如浆细胞、肾上腺皮质细胞）则十分复杂，且占细胞质的很大部分。内质网可分为粗面内质网和滑面内质网。subsubsection粗面内质网粗面内质网（rough endoplasmic reticulum，RER）的表面附有核糖体，它可以是少数小的游离囊泡，也可以形成广泛互相连接的囊泡，但大多数为扁平状、管状或泡状，而且往往可见到核膜外层与粗面内质网相连续。除哺乳动物的红细胞外，几乎所有的真核细胞都含有粗面内质网。在旺盛合成和分

13、泌蛋白质的细胞（胰腺外分泌细胞、浆细胞）中粗面内质网发达，而在幼稚的细胞或分化低、生长快的肿瘤细胞中，粗面内质网不发达，且数量很少。由于粗面内质网的表面附着核糖体，而核糖体是合成蛋白质的场所，因此，粗面内质网的功能与蛋白质合成及运输有关。所以，细胞中，粗面内质网的多少，常常可作为估计细胞分化程度和功能状态的一个指标。subsubsection滑面内质网滑面内质网（smooth endoplasmic reticulum，SER）表面没有附着核糖体，通常呈分支小管或小泡的不规则的网状结构，多数分布在细胞的边缘，且常和粗面内质网相连。滑面内质网存在于许多不同类型的细胞，其功能也多样，并不具有一种共

14、同的功能。如肝细胞、分泌固醇类激素的细胞、壁细胞、小肠上皮细胞等都有发达的滑面内质网，但它们的功能却是不同的。肝细胞的滑面内质网与解毒作用、胆汁分泌、脂类代谢、糖代谢等功能有关；分泌固醇类激素的细胞的滑面内质网与胆固醇的合成有关；胃底腺壁细胞的滑面内质网可能与盐酸的分泌及渗透压的调节有关；心肌和骨骼肌细胞的滑面内质网构成复杂的肌桨网，能释放及获取钙离子，与肌细胞的收缩、舒张有关。总之，滑面内质网的功能是多种多样的，它依细胞的类型而有很大的差别。subsubsection病毒引起的内质网的变化不管怎样，内质网是与蛋白和其它物质合成和运输的地方。因此，很多病毒入侵后，内质网的病变都比较明显。病毒在

15、形成过程中，需要内质网上的核糖体合成其蛋白，而且需要内质网系统进行物质运输，有些甚至干脆把内质网作为病毒蛋白组装的场所。这些都可引起内质网发生严重的病变。如，SARS CoV入侵Vero细胞后7小时不到，内质网就发生膨胀，并可看到膨胀的内质网内有子代病毒粒子的组装(图图11)。病变初期，粗面内质网上的核糖体颗粒虽仍可见到，但数量明显减少，随着病变发生的程度进一步增加，核糖体会脱落，同时，内质网膨胀的程度也可增加，呈空泡或囊状结构。膨胀的内质网内腔的物质也会有不同的变化，有些内质网膨胀成囊状结构后，其内的物质减少而呈明显的空泡(图图12)，有些腔内会有中等电子密度的蛋白性物质存在(图图13)。s

16、ubsection病毒引起的细胞核的变化subsubsection正常的细胞核细胞核（nucleur）几乎存在于所有的真核细胞中。不同种类的细胞细胞核的数量有所不同，但结构基本类似。细胞核由双层核膜包裹，两层核膜之间的间隙为核周间隙，宽度约1050nm。核膜上的核孔是由内外层核膜融合形成。在一般超薄切片中，当切面通过核表面时，则见核孔呈圆形，彼此分离核孔复合体（nuclearpore complex）。孔径30100nm核孔占核膜表面积的$5%15%$。一般来说，分化程度低及合成代谢旺盛的细胞，核孔数多；而分化程度高的细胞，核孔少，如在成熟的精子几乎没有核孔。核孔是细胞核与细胞质之间物质转运的

17、结构基础，并可能具有开启和关闭的作用。间期核中，异染色质呈电子密度高的染色质颗粒，聚集成大小不等的块状，不规则地分散在细胞核内。而常染色质呈浅亮区，分布于核中央，异染色质之间及核仁内外。常染色质和异染色质在结构上是连续的，不能截然分开。二者的分布和比例亦非固定不变，常因细胞的种类，生活周期及功能状态的不同而互相转化。一般来说，分化程度高的细胞异染色质多，如精子、嗜中性多核细胞；分化程度低的细胞和增殖速度快的细胞常染色质所占的比例多，如胚胎细胞、肿瘤细胞等。核仁着色深，无界膜，呈绳索状交织的海绵结构，有时切片的角度也可能造成核仁在观察时与大块的异染色质类似。核仁不是固定的结构，它在细胞分裂时有周

18、期性的变化。在分裂前期核仁消失，到分裂后期，它又在核仁组织区（nucleolus organizer regions）内重新出现。核仁的功能是合成核糖体核糖核酸（rRNA）的场所，故与蛋白质的合成密切有关。核仁的大小和数量常反映细胞的生理状态。在蛋白质合成活跃的细胞，如胰腺细胞，核仁发达，大而明显，或有多个核仁；在蛋白质合成不活跃的细胞，如肌细胞和精母细胞等，核仁不明显或小或无。核液（nuclear sap）又称核基质（nuclear matrix），是一种无定形基质，染色质及核仁浸埋其中。核液含有可溶性RNA。糖蛋白及其它物质。细胞核是遗传信息的物质基础脱氧核糖核酸（DNA）的复制及贮存场所

19、，在一定的程度上控制着细胞的代谢、生长、分化和繁殖等的活动。细胞核的化学成分主要是核酸和蛋白质组成的核蛋白，蛋白质主要是碱性蛋白质，如组蛋白等；核酸多为DNA，RNA则较少。此外，细胞核内还含有酶、多糖及无机盐等。subsubsection病毒引起细胞核的病变病毒入侵宿主细胞引起细胞核的变化主要表现在以下几个方面：1，改变细胞核的大小、形态；2，引起染色质性质发生变化；3，改变细胞核膜的结构；有些病毒，如昆虫核多角体病毒，入侵宿主细胞后可引起细胞核体积增大；有些还可引起细胞核形态发生变化。核内染色质的变化主要体现在异染色质的增加。这是最常见的病毒感染后细胞核的变化，而且这些异染色质常很不均一地

20、分布，如昆虫细胞感染核多角体病毒厚，异色质不均一分布，形成了特殊的病毒发生基质结构（图 图14）。还有些病毒感染后，可导致核膜发生一系列的变化。如SARS CoV感染Vero E6细胞后，可看到有些地方双层核膜发生扩张，形成一个囊泡状的结构，这个囊泡状结构还可包裹病毒粒子(图图15)。如Vero E6细胞感染疱疹病毒后，细胞核双层核膜中间可形成一层电子密度较深的物质(图图16)。病毒感染后期，比较常见的细胞膜病变是细胞膜破裂不完整，使细胞核与细胞质界限变得不清晰，最后细胞核碎裂。subsection高尔基复合体高尔基复合体（Golgicomplex）由扁平囊、大泡和小泡三部分组成。扁平囊（Go

21、lgi saccule）呈盘状(图图17)，由单位膜构成，囊的中部比较狭窄，边缘稍膨大，通常可以观察到3-8个扁平囊互相平行叠在一起，典型的为9层扁平囊叠在一起。扁平囊有凸面和凹面，小泡直径40-60nm，常见于扁平囊的凸面，大泡直径约0.1-0.5m，常见于扁平囊的凹面。不同类型细胞的高尔基复合体的数量、位置和分布是不同的。在排列有极性的柱状及立方上皮细胞内，一般位于核及游离面之间；在肝细胞中，则分为若干堆分散在细胞质中；在神经细胞中，则包围在整个细胞核的周围。高尔基复合体的大小和数量也因不同的细胞类型而差别很大。例如，神经细胞和胰腺细胞的高尔基复合体较大，肌细胞内的则小。此外，在同一类细胞

22、中也可由于不同生理状态而有所改变：细胞处在发育时期或机能旺盛时多；细胞机能低落或未分化时少；细胞处于衰老过chsh小、少或消失 。病毒感染细胞后，初期可引起高尔基体囊泡增生，随后，可导致那侧高尔基扁囊膨胀成大囊泡，病毒粒子可包含到这些囊泡中(图图18)subsection核糖体及其病毒引起的变化核糖体（ribosome）大小约15×25nm，呈现为染色较深的小颗粒。除成熟红细胞外，其它各种细胞都存在有这种细胞器，它是合成蛋白质的部位。它是由核糖核酸和蛋白质组成。核糖体在细胞内的分布有两种形式，即附着在内质网表面上的称为附着核糖体，游离在细胞质中的称游离核糖体。附着核糖体是以其亚大单位

23、附着在内质网膜上，它所合成的蛋白质分泌到细胞外面。游离核糖体所合成的蛋白质主要为内源性蛋白质或可溶性蛋白质，这些蛋白质主要是供细胞本身增殖、代谢所需，游离核蛋白体也合成某些特殊功能的蛋白质如血红蛋白、肌动蛋白和肌球蛋白等。在一些分泌细胞中如分泌胰液的胰腺细胞和分泌抗体的浆细胞中，大部分核糖体是附在内质网上的；而在未分化细胞、淋巴细胞等，则多见游离核糖体。核糖体由mRNA把单个的核糖体串连一起，成为能合成蛋白质的功能单位，称为多聚核糖体。附着的或游离的核糖体都有呈多聚核糖体的型式，在电镜下呈针簇状，菊花状或唸珠状的长链，或以平螺纹的排列形式附着内质网膜表面，或游离于胞质中。多聚核糖体所集结的核糖

24、体的数目与有关的mRNA的长度有关，也和所合成的有关蛋白质的分子大小有关，小的仅几个核糖体连结在一起，多的则可几十个核糖体。病毒感染时，可造成宿主细胞的核糖体大量合成病毒生命过程中所需的蛋白。病毒感染初期往往可造成宿主细胞的各种形态的核糖体数量明显增加(图图19)，而在后期，病毒感染又可引起核糖体从粗面内质网上脱落。subsection其它细胞器及其病毒引起的变化溶酶体（lysosome）是由单位膜包围而成的囊状结构，直径约0.25-0.5m。在电镜下，溶酶体的形态很多，往往凭一般常规电镜技术方法不易区别，需用电镜细胞化学技术，特别是显示酸性磷酸酶的方法。溶酶体普遍存在于哺乳动物各种细胞中，不

25、过数目不多。在植物细胞中，也发现类似溶酶体的细胞器，但在细菌中没有发现溶酶体。根据溶酶体消化活动的机能状态以及是否含有“底物”，将其分为初级溶酶体和次级溶酶体两大类。病毒感染的宿主细胞有时可见溶酶体的增生。细胞内还有其它的细胞器，如微体、微管微丝、脂肪滴等。病毒有时也会引起这些细胞器的变化，主要体现在数量上的改变。subsection病毒感染后细胞内产生的特殊结构病毒感染宿主细胞后，除了能造成细胞内原有细胞器结构、数量、形态等发生改变外，还可在宿主细胞内形成特殊的结构。主要有：病毒发生基质、包含体、多角体、微管、病毒伴随颗粒等。如昆虫核多角体病毒在病毒形成过程中，能造成细胞核内异染色质形成网状

26、的病毒发生基质(图图14)，随着病毒发生的继续，最后还在核内形成了多角体，病毒成熟后，进入多角体内(图图20)。出血热（EHF）病毒可造成细胞内形成大片的丝状的包含体(图图19)。白纹伊蚊被浓核病毒感染后，细胞质内可出现晶格样排列的包含体(图图21)。section病毒在细胞中的生活周期电子显微学技术是揭示病毒入侵机理，阐明病毒的发育循环，研究感染宿主病理学的一个重要方法。常规的超薄切片技术能够为病毒的入侵、复制、组装以及宿主病变状况提供最直观的形态学证据，并与其它生化、分子生物学的实验结果互相佐证，解释病毒与细胞的相互作用机理。免疫学技术、核酸分子杂交技术与电子显微学技术相结合而发展起来的免

27、疫电镜技术和电镜原位杂交技术使我们能在观察细胞超微结构的同时，对病毒的蛋白和核酸进行精确定位，而且通过对不同时期的感染细胞进行跟踪观察，确定这些分子在细胞内的动态分布过程，从而有效地阐明病毒增殖机制。subsection病毒的入侵电镜作为一种研究病毒的强有力的工具，在病毒入侵方面可以带来两方面的信息：病毒与受体的结合状况和病毒入侵细胞的方式。病毒与受体的结合状况包括结合部位，结合后病毒衣壳的变化情况和结合后受体的变化情况，这对了解病毒和防治病毒是非常重要的。这一方面的研究主要利用免疫电镜和冷冻电镜等技术。病毒入侵细胞的方式有核酸注入式（如T噬菌体等）、膜融合式、内吞式等。这些方式最初都是由电镜

28、观察超薄切片的研究中首先发现的。此后，其它方法也应用到入侵方式的研究中，但电镜以其直观的优点，提供直接的证据。核酸注入方式入侵细胞时，病毒衣壳并不进入宿主细胞，如噬菌体入侵宿主细胞(图图22)时，首先其尾巴识别宿主细胞受体，并通过其尾巴附着细胞上，然后尾巴穿过宿主细胞，或相关蛋白在宿主细胞膜上形成一通道，使衣壳内的核酸注入宿主细胞，然后核酸在宿主细胞内进行复制、表达等一系列生命活动。膜融合的方式主要发生在有囊膜的病毒中，病毒入侵细胞时，其囊膜与细胞质膜发生融合，时囊膜内的核衣壳进入宿主细胞，然后在宿主细胞内完成脱衣壳、核酸复制等过程，完成入侵的过程。如， SARS冠状病毒（SARS coron

29、avirus，SARSCoV）入侵Vero E6细胞的方式。SARS CoV属于冠状病毒科（Coronaviridae），冠状病毒属（Coronavirus）。它是一种正义单链RNA病毒。取感染SARS CoV不同时期的Vero E6细胞进行大量超薄切片观察，在感染早期的细胞中观察到SARS CoV入侵细胞的过程。图refappVirusEntryb可以看到，SARS CoV首先吸附在Vero E6细胞表面，病毒的囊膜与宿主细胞的细胞膜融合，随后核衣壳进入细胞。图中还可看到刚通过细胞膜的SARS CoV的核衣壳边界模糊，没有明显囊膜结构，整个粒子的电子密度均匀。说明SARS CoV进入细胞后，

30、已去除了外面的囊膜结构，只有病毒的核衣壳进入了宿主细胞。经大量观察，没有发现内吞后膜融合进入的病毒粒子。而内吞方式是病毒识别宿主细胞后，细胞膜结构发生变化，形成内吞泡，将病毒吞噬，病毒由此进入宿主细胞的过程。这种方式可以发生在有膜或无膜的病毒种类中。正如以上所说，病毒入侵细胞的方式，很多都是通过电镜直接观察到的。通过电镜还可为分子生物学和其它生物学研究成果提供依据。如使用电镜观察家蚕质多角体病毒（Bombyx mori cypovirus1，BmCPV-1）入侵家蚕中肠柱状细胞的方式。BmCPV-1是呼肠孤病毒科（Reoviridae），质多角体病毒属（Cypovirus）的代表种。它是一种无

31、囊膜的双链RNA病毒，其入侵方式存在争议。1972年小林正彦认为它以一种类似于T噬菌体的注入式入侵方式进入细胞，病毒粒子的突起前端吸附细胞表面，突起埋进细胞表层，从衣壳顶点释放纤维状的病毒核酸到细胞的内并进行复制，释放出髓核物质的空心的病毒衣壳仍留在细胞外边。然而分子生物学和冷冻电子显微技术的研究结果表明：BmCPV的RNA聚合酶是病毒复制所必需的，而RNA聚合酶处于病毒衣壳突起的内壁上，如果病毒衣壳仍然留在细胞外边，那么RNA聚合酶也就不会进入细胞，那么病毒的复制将无法进行，显然这种注入式的入侵方式不适合于BmCPV的情况。为了弄清BmCPV的入侵方式，活体感染二龄起蚕，添毒后在不同时间大量

32、取样、制作超薄切片和电镜观察，清楚地直接观察到BmCPV是以整个病毒粒子穿过细胞膜的形式入侵中肠上皮细胞，见图refappVirusEntrya，这种穿膜入侵方式是首次报导的。beginfigurehtbpcenteringincludegraphicstotalheight=8cmappVirusEntrycaption(a)完整的BmCPV病毒粒子通过直接穿膜方式进入柱状细胞微绒毛（横切面）。右上方插图为病毒穿绒毛膜的局部放大图。Mv：微绒毛。Bar=100nm。(b)SARS CoV入侵细胞过程。SARS CoV（黑色箭头指示）吸附到细胞表面，病毒囊膜与VeroE6细胞的细胞膜融合，释放

33、出病毒核衣壳，白箭头指示释放到细胞质中的模糊的病毒核衣壳。Bar=100nm。citeTan2003labelappVirusEntryendfiguresubsection病毒的繁殖病毒感染细胞首先是识别、吸附细胞，然后核酸进入宿主细胞开始病毒的复制过程。病毒的繁殖包括病毒核酸的复制、病毒蛋白的合成、病毒粒子的组装以及释放。电子显微学技术（包括超薄切片，免疫电镜技术以及电镜原位杂交技术）的应用，给我们提供了这些重要环节的形态表征以及发生的时间和空间信息。病毒核酸复制的过程，主要可以通过电镜原位杂交技术进行研究。如研究家蚕质多角体病毒（BmCPV）。为了检测病毒核酸的复制场所和复制开始的时间，

34、可以根据双链RNA病毒在复制过程中先产生单链正链RNA，再以此链为模板合成负链从而形成双链RNA的特性，采用电镜原位杂交技术，检测柱状细胞内BmCPV的核酸复制中间体-正链RNA的分布，以确定病毒核酸的复制场所。从第6小时样品开始，检测到阳性杂交结果，显示病毒正链RNA最先出现在中肠柱状细胞的核内，并且相对集中分布在核仁上，核基质中也有分布，但数量较少。第12小时(见图refappBmCPVRNA)，病毒正链RNA大量富积在核仁上，部分开始向核膜移动，双层核膜间隙中观察到病毒正链RNA，核外也观察到少量病毒正链RNA。显示病毒正链RNA在细胞核仁上合成后通过核膜运到细胞质中。柱状细胞顶端胞质中

35、观察到少量病毒正链RNA出现在核糖体上。说明病毒正链RNA作为mRNA指导蛋白的合成。第24小时，病毒正链RNA均匀分散在胞质的一个小区域内，该区域内无细胞器，可能是病毒发生基质将要形成的地方。另外，有些区域病毒发生基质已形成，病毒正链RNA出现在该基质的边缘，暗示病毒单链核酸运到基质中与病毒蛋白装配。出现在病毒发生基质中的子代病毒，其中未成熟的病毒颗粒被标记，暗示病毒颗粒装配中存在单链基因组阶段，但该阶段可能非常短暂，因多数病毒颗粒都未被标记，显示其内的核酸已经为双链。推测单链正链RNA与病毒蛋白形成病毒粒子前体后，立即在病毒粒子前体内合成负链从而形成双链RNA基因组。第48小时，包埋在多角

36、体内的成熟病毒粒子均未标记上胶体金，这是因为其核酸是双链RNA形式。beginfigurehtbpcenteringincludegraphicstotalheight=6cmappBmCPVRNAcaption感染BmCPV第12小时柱状细胞核内的病毒正链RNA开始向细胞质运输。大量病毒正链RNA（箭头指示）富积在核仁（Nu）上，部分开始向核膜移动，双层核膜间隙观察到病毒正链RNA（三角形指示），有的核外观察到少量病毒正链RNA（钻石箭头指示），显然病毒正链RNA在核仁上合成后开始通过核膜运到细胞质。Bar=100nm。labelappBmCPVRNAendfigure病毒蛋白质的表达和病毒

37、粒子的组装和运输等过程，可以通过免疫电镜进行研究。例如我们使用电镜技术研究BmCPV在家蚕中肠柱状细胞中的增殖过程：首先通过观察不同感染时期的家蚕中肠柱状细胞的常规超薄切片，发现在感染后第3小时，才观察到大量亲代病毒粒子进入柱状细胞内，除分布在细胞质，还出现在细胞核内。在双层核膜间隙、核基质内均观察到病毒粒子，暗示了病毒穿过核膜进入到核内。亲代病毒似乎在进入细胞核内之后，才降解消失。而随后的612小时都未观察到病毒颗粒。这说明从病毒侵入细胞，到产生子代病毒之间存在一段隐蔽期。在感染第24小时，中肠柱状细胞顶端细胞质内出现了病毒发生基质和子代病毒（见图refappBmCPVprotein），免疫

38、标记结果表明病毒蛋白集中分布在病毒发生基质内及其周围的核糖体上。基质的外层区免疫标记较多，基质内的病毒衣壳也被标记上。这暗示了病毒蛋白从核糖体合成出来后集中到病毒发生基质中，随后组装到病毒的衣壳上。beginfigurehtbpcenteringincludegraphicstotalheight=6cmappBmCPVproteincaption感染BmCPV第24小时的中肠样品的免疫标记。胶体金（箭头指示）出现在病毒发生基质内及其周围的核糖体上。病毒发生基质（VS）的微网结构中和病毒粒子衣壳上出现胶体金。Bar=100nm。labelappBmCPVproteinendfigure第48小

39、时，多角体出现在病毒发生基质中，多角体内的病毒粒子也被标记上，柱状细胞基部出现的病毒发生基质和病毒粒子也被标记。在感染的第48小时(见图refappBmCPVassembly)，大量成熟或未成熟病毒粒子被包埋在多角体蛋白中形成多角体。柱状细胞的基部也开始出现病毒粒子和病毒发生基质。为了弄清楚BmCPV蛋白的合成动态，可以应用了免疫电镜技术来检测在不同感染时期内，病毒蛋白在柱状细胞内的分布。发现在感染第6小时样品免疫标记结果为阴性，即此时间段内未检测到病毒蛋白，病毒蛋白的合成可能还未开始。而感染的第12小时样品检测到弱阳性免疫反应结果，在柱状细胞顶端的胞质内以及核糖体上出现少量被标记的病毒蛋白，

40、但此时未观察到病毒发生基质和可辨的病毒颗粒，显然病毒的组装还未开始。beginfigurehtbpcenteringincludegraphicstotalheight=6cmappBmCPVassemblycaptionBmCPV病毒粒子的不同发育阶段。感染48小时，病毒成熟过程中观察到有突起的空病毒（）（仅有衣壳）、部分填充的病毒（）和完整的病毒（）同时存在的情况，代表病毒发育的不同阶段。Bar=100nm。labelappBmCPVassemblyendfiguresubsection病毒的释放成熟病毒粒子的释放有多种途径。很多病毒感染细胞后，在宿主细胞内大量繁殖可导致细胞破裂，病毒释放

41、出体外。也有很多病毒，尤其是戴囊膜的病毒，则通过细胞内运输系统，将病毒运输至细胞膜，而后，病毒通过出芽方式，带上囊膜的同时，释放到细胞外。此外，还有病毒粒子通过胞吐方式释放到细胞外面。这些过程都可通过电镜直观地观察到。如，SARS CoV的释放过程(图图23)。section病毒的电子显微学鉴定目前最常用的病毒性疾病的鉴定技术一般包括：电子显微学技术、免疫学技术和分子生物学技术。这几种方法各有其优势：当有明确的怀疑目标病原，并有确定的抗体等存在时，无需太多的仪器设备，只需一些试剂盒和常规的分子生物学和免疫学仪器，就可利用分子生物学和免疫学技术进行快捷简便的诊断。而病毒的电子显微学诊断和鉴定技术

42、更多地应用于疑难病例、其它方法难以解决以及新病毒、新病原出现时的鉴定。事实上，在PCR等现代分子生物学和免疫学手段建立之前，许多病毒都是由电镜所发现和确定的。不管何种技术，病原的确诊都需要符合柯赫氏法则。在柯赫氏法则中的第一条，电镜可以对病原的形态结构进行很直接的观察，可以初步确定是否每个病体中具有同样的病原。在柯赫氏法则的其余三条中，电子显微学对分离的病原的形态特征和其引起的超微结构变化的描述都起到了很重要的作用。可见，电子显微学技术能直接观察病毒形态结构、数量以及病毒侵染寄主后引起的细胞超微结构变化等的特点，很多时候使人们能马上凭这些信息即可判断这是什么病毒以及它是否是病原体等问题。因此也

43、使它称为病毒性疾病诊断和鉴定中最有用的工具之一。电镜在不但在以前的病毒诊断和鉴定中曾起着非常重要的作用，现在和将来，它仍是不可替代的最重要的病毒，尤其新病毒的诊断和鉴定的工具。目前，在病毒的诊断和鉴定中经常用的电子显微学方法包括负染色法和超薄切片法，结合免疫电镜技术还可以判断病毒的血清学关系，研究病毒在细胞内的复制装配等。除此之外，冷冻电镜单颗粒技术等所获得的高分辩结构也可作为病毒鉴定的依据。这些技术的详细技术要点见本书的其它章节。subsection病毒电子显微学鉴定的依据病毒的电子显微学诊断鉴定的依据主要包括：病毒的形态学特征依据、病毒形态发生学的依据，也就是病毒与宿主细胞的关系和引起的病

44、变；免疫电镜的依据，即电镜下观察特异抗原抗体复合物聚合物和标记的抗原抗体物质。subsubsection形态学特征依据主要包括beginenumerate item 病毒的大小； item 病毒形状，如球状，还是丝状、弹状、杆状等； item 有没有突起，突起的长度、分布情况、突起的形态和位置等； item 有没有囊膜，囊膜的形态，囊膜表面有没有纤突，纤突的形状、长度和间距等； item 病毒衣壳的对称性，是立体对称还是螺旋对称、是单层衣壳还是多层衣壳、壳粒的数目和排列方式等。endenumerate根据这些特征，在植物病毒的鉴定中，花椰菜花叶病毒科(caulimoviridae)、双生病毒科

45、(Geminiviridae)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、苜蓿花叶病毒属(Alfamovirus)、欧尔密病毒属(Ourmiavirus)、油橄榄病毒属(Oleavirus)等都具有特殊典型的形态学特征，通过负染色即可在电镜下确定其归属。对于烟草花叶病毒等螺旋对称的杆状病毒和马铃薯Y病毒等线状病毒，可以直接用病变组织汁液的负染色观察，依据病毒粒子的大小和弯曲程度进行鉴定，一般可判断到科或属。而细小的球状病毒，不易用病变组织的粗汁液直接进行电镜观察，大多需要将病毒进行提纯后方可进行电镜鉴定。虽然球状病毒形态相似，但还是可以根据病毒粒子的外形进

46、行初步判断。人和动物病毒同样可以根据形态学特征进行鉴定：如引起人腹泻的病原就利用电镜下病毒的形态特征很容易发现，引起人腹泻的病毒有冠状病毒、呼肠孤病毒、轮状病毒和腺病毒。subsubsection病毒形态发生学的依据病毒在细胞内的排列、复制、组装和成熟的过程以及某些包膜病毒的芽生部位和病毒包涵体（病毒基质）的形态特征等。大多数有囊膜病毒都有一个脂质双层包膜和相关的蛋白，在相应的细胞膜上发芽成熟，有的病毒在细胞质膜上发芽，有的则在内质网膜、核膜或高尔基扁囊和囊泡膜上发芽。病毒在形态发生过程中形成的包涵体的形态特征同样也是病毒诊断鉴定的重要依据：现有资料表明，在植物病毒中至少有19个病毒科或属的成

47、员产生不同的包涵体，可以与其它科或属区分开来。最典型的如马铃薯Y病毒科的柱状包涵体，烟草花叶病毒属的结晶体和X体、花椰菜花叶病毒的病毒基质等。有些细胞病理变化特征还有助于区别病毒的种甚至株系，如番茄花叶病毒在细胞内形成角层状聚集体，不产生X体，与同属的TMV等有明显区别。subsubsection细胞病变依据不同科或属的病毒引起细胞发生病变的程度、特征也是很不一致的。这些特性有时从光学显微镜就可观察到。电镜下，一些细微的特征更能帮助人们诊断。如人们在寻找SARS病原时，先后分别在病人身上发现了副粘病毒，疱疹病毒，呼肠孤病毒和冠状病毒等，这些病毒所引起的细胞病变就非常不同。冠状病毒引起细胞病变一

48、个非常典型的特征是使细胞严重空泡化，而疱疹病毒入侵细胞后，细胞变空的病变并不严重。subsubsection免疫电镜学依据电镜下观察聚集成堆的抗原抗体复合物或标记的抗原抗体复合物是病毒诊断鉴定非常准确和有效的工具。1973年，美国学者Feinstone等就是首次以免疫电镜技术发现了甲型肝炎病毒颗粒。他们以患者急性期粪便提取液与恢复期病人血清混匀孵育，然后对其沉淀物的悬浮液进行电镜观察，发现大量被抗体凝集的2732nm的病毒颗粒，病毒呈二十面体对称，无囊膜，免疫电镜下病毒颗粒表面可见放射状和绒毛状抗体桥。subsection病毒电子显微学鉴定的特点病毒的电子显微学诊断的快速和简便是其它手段难以达

49、到的。如通过对患病个体的水样粪便、口腔或鼻咽拭子、皮肤的水疱液以及各种脏器、组织进行简单的处理，数分钟或十多分钟即可做出早期的诊断。这就是电镜诊断方法至今仍被广泛采用的原因所在。一般情况下，在电镜下根据病毒的形态学特征可以鉴定到病毒的科甚至种。这对于那些需要复杂培养条件和尚不能在体外细胞培养中增殖的病毒尤其有用。因此，病毒的电子显微学诊断的快速和简便是其第一个特点。通过电镜的诊断鉴定，可发现新的病毒致病因子是病毒电子显微学诊断的第二个重要特点。很多实例证明电镜是第一个从病人临床样品中检出病毒颗粒，作出病原鉴定。如乙型肝炎(肝DNA病毒科的乙型肝炎病毒)，婴幼儿腹泻(呼肠孤病毒科的轮状病毒)和流

50、行性出血热病毒(布尼安病毒科的汉坦病毒)等。在新的疾病，尤其新的病毒性疾病发生和流行时，电子显微学技术是寻找未知病原，鉴定病原最重要的诊断鉴定技术。第三个重要特点是对一些疑难病例，两种甚至多种病毒的合并感染或合并其它病原入侵等的诊断时，电子显微学诊断相对直观、可靠特点使其有特别的优势。虽然临床上普遍使用免疫学、分子生物学等手段进行疾病的诊断。但众所周知，目前人和各种养殖动物在各个阶段都普遍接种各种疫苗，很多病毒的抗原具有交叉反应，这给单纯利用血清学技术诊断带来混乱，使单纯检测抗体的方法来诊断病毒性疾病难以进行。而且对于一种未知具体病原体的的疾病，由于没有确定的抗体，也无法用免疫学手段进行诊断。

51、分子生物学诊断技术主要利用PCR或RTPCR等技术，对于已知具体病毒的疾病的确定是比较快速的方法。但对于某种突发性疾病，又没有明确的病原时，这种方法的诊断就显得有点大海捞针了。因为没有明确的目标时，不能选用特异性引物，只能用随机引物进行检测，此时获得扩增的核酸片段的数量就很巨大，这使单一的分子生物学诊断也显得比较困难。而且，生物体往往非常复杂，有时很多的微生物存在在生物体内，但它们并非是病原体，从原理上来说，PCR方法只能确定某种病毒的存在，但不能判断它是否是病原体。另外，很多实验表明免疫学及PCR检测都可出现程度不等的假阴性或假阳性，在这些用一般的光学显微镜、血清学和分子生物学等方法感到无能

52、为力时，尤其对未知病毒或者那些不易被发现的病毒，传统的电镜技术往往起着举足轻重的作用。许多病毒仅仅根据其微细结构特征就足以用电镜进行鉴别，有的病毒在它的致病作用远未搞清以前就被电镜发现了，这种情况无论在体外或体内都有不少先例可借鉴。以下几个例子可以说明电子显微学在发现新的病毒致病因子以及疑难病例中的应用。subsection病毒电子显微学诊断鉴定的实例subsubsection电子显微学诊断鉴定技术在新出现的疾病中的应用在2002年底爆发的SARS疫情的病原寻找过程中，不同国家、地区都不约而同地用到了电子显微学技术，也有很多这方面的报道。在报道非典型性肺炎爆发后，一星期内，2003年2月18日

53、我国研究人员通过电镜观察，在两份死于本次肺炎病人的尸检肺标本中，发现了典型的衣原体的包涵体，而肺细胞浆内衣原体颗粒十分典型。虽然现在看来这个论断并不正确，但它毕竟拉开了寻找SARS病原的序幕，也揭开了SARS神秘面纱的一角。3月18日德国用电镜在咽拭子标本中观察到副粘病毒。3月19日新加坡从病人呼吸道标本中发现副粘病毒颗粒并使用香港中文大学的Metapneumo病毒扩增引物获得较微弱的病毒基因扩增产物。3月20日香港中文大学在电镜下发现副粘病毒颗粒，同日国际上首先发现Metapneumo病毒的荷兰鹿特丹实验室检测到副粘病毒，但是Metapneumo病毒基因扩增为阴性。3月21日香港中文大学在猴

54、肾细胞培养物中分离到病毒，随即研制了相应的血清学诊断试剂。香港大学QueenMary医院微生物病理系的Peiris等是最早报道应用负染和超薄切片电镜技术从SARS患者生前肺活检组织以及鼻咽部吸出物的病毒分离培养物中发现冠状病毒的。美国从用泰国病人标本感染培养细胞，引起细胞病变的产物中也发现冠状病毒样颗粒（70-100nm），并在同一份标本获得HMPV病毒PCR阳性结果。3月23日香港病毒实验室在8份标本中发现其中2份含有冠状病毒RNA；美国报道在香港标本中发现冠状病毒，同时建立免疫荧光检测病人血清的方法并将冠状病毒的基因扩增引物在网络公布。在新加坡和香港开始用鼻咽拭子支气管感染的方式进行非人类

55、的灵长类动物实验。加拿大和法国也分别用电镜和PCR方法发现冠状病毒。此后，不同地区的科研人员都陆续报道了，利用负染技术和超薄切片技术在电镜下对SARS患者分离物感染的绿猴肾细胞(VeroE6)进行研究，诊断出引起SARS的SARS CoV。作者也使用电子显微学技术等也在同期分离到SARS CoV，并对其形态发生进行了研究，完整地描述了该病毒在Vero E6细胞中的生活周期。在电镜下观察经负染色处理的SARS患者咽拭子感染的Vero E6细胞上清，可看到病毒粒子大小不等，直径在60120nm之间，病毒粒子的形状呈近似圆形、椭圆形等多种形态，外面的囊膜上有长1020nm的纤毛状突起，这些纤突排列较

56、整齐，呈冠状分布。对病变Vero E6细胞进行超薄切片，透射电镜观察发现，病变细胞有较多的空泡，线粒体外膜或嵴溶解，病毒通过膜融合入侵细胞，在粗面内质网内膜上芽生成熟，在感染细胞扩张的核周隙和粗面内质网池中常有数目不等的病毒样颗粒，细胞质中的病毒样粒子大多聚集在一堆，有些病毒样粒子未带有囊膜，直径大多数在50nm左右，有些粒子已带有囊膜，其形态结构与细胞外的粒子基本一致（图refappSarsIdentify）。成熟的病毒粒子经胞吐释放到细胞外。beginfigurehtbpcenteringincludegraphicstotalheight=6cmappSarsIdentifycaptio

57、n SARSCoV感染的细胞质中，病毒样粒子大多聚集在一堆，有些粒子未带有囊膜，直径大多数在50nm左右，有些粒子已带有囊膜（箭头所指）。（bar100nm）labelappSarsIdentifyendfigure4月14日加拿大及美国已绘制出了怀疑与SARS相关的新型冠状病毒的基因组序列图，证实了怀疑与SARS相关的病毒是一种全新的冠状病毒。在一系列有利证据的支持下，世界卫生组织负责传染病的执行干事海曼4月16日宣布，经过全球科研人员的通力合作，终于正式确认冠状病毒的一个变种是引起SARS的病原体。这种新型冠状病毒（SARS CoV）被证明符合科赫法则（Kochs Postulate），因此被认定为SARS的病原。subsubsection SARS确诊病人分离物中发现其它合并感染的致病因子电镜对病毒感染者合并其它病原入侵的诊断往往特别有用。如在SARS确诊病人的咽