亚低温对实验兔全脑缺血再灌注损伤早期

1、亚低温对实验兔全脑缺血再灌注损伤早期血浆IL-1、TNF、IL-10表达的影响万丽 黄焕森 赖永东 胡春旭 高崇荣（广州医学院第二附属医院麻醉科510260）摘要 目的 研究全脑缺血再灌注损伤早期血浆IL-1、TNF、IL-10表达的变化，以及局部脑组织亚低温对脑缺血再灌注损伤炎性反应的影响。方法 健康新西兰大耳白兔24只，随机分为正常对照组（组），常温缺血再灌注损伤组（组），亚低温缺血再灌注损伤组（组）。采用双侧颈总动脉夹闭低血压脑缺血模型，、组行脑缺血30min，再灌注3h；组在双侧颈总动脉夹闭的同时行局部脑组织亚低温处理，维持至再灌注后3h。常规监测鼓膜温度、MAP、CVP，分别于缺血前

2、、缺血后30min、再灌注30min、1h、2h、3h采血检测SavjO2， ELISA方法检测血浆IL-1、TNF、IL-10表达。结果 组血清IL-1、TNF表达明显高于组和组，P <0.05, 组IL-1、TNF表达低于组，但高于组，与组和组相比，差异具有显著性，P <0.05。组血清IL-10表达明显高于组和组，三组间两两相比，差异具有显著性。常温缺血再灌注损伤后SavjO2下降，与缺血前相比，差异具有显著性，亚低温处理后SavjO2略高于常温缺血组，但两组间相比，差异无显著性。结论 局部脑组织亚低温能减少血浆IL-1、TNF表达，增加IL-10表达，减轻缺血再灌注损伤的炎

3、性反应。关键词 脑缺血再灌注损伤；亚低温；细胞因子The effect of sub-hypothermal to the local cerebral on the expression of the IL-1、TNF、IL-10 in the plasma after globel cerebral ischemic/ reperfusion injury in rabbits.Abstract Objective To explore the expression of the IL-1、TNF、IL-10 in the plasma and the effect of the sub-

4、hypothermal to the inflammation response after global cerebral ischemic /reperfusion injury.Methods 24 health New Zealand rabbits were randomly divided into normal control group (group),normal thermal ischemic/reperfusion group(group ),sub-hypothermal ischemic/reperfusion group(group ).The model mad

5、e by occlusion the bilateral common carotid arteries for 30min combined with hypotension，which produced by blood-letting and maintained at 50-60% of the baseline level.The vessels then released for reperfusion and BP was returned to baseline level by retrieval of the removed blood.Group and group we

6、re ischemiced for 30min and reperfusion 3 hours, local cerebral sub-hypothermal was gived to group for 3 hours combined with the same ischemic/reperfusion.The temperature of the ,MAP,CVP were recorded and the artery blood-gas , SavjO2 were detected before ischemic,post ischemic for 30min,reperfusion

7、 for 30min,1,2,3 hours.ELISA method was used to detect the IL-1、TNF、IL-10 expression in plasma.Results The expression of the IL-1、TNF were significantly increased in group ,compared with groupand ,the difference was significant, P <0.05,and the expression in group is lower than group ,but higher

8、than group,the difference was significant.The expression of IL-10 is increased significantly in group ,compared with group and group,there were significant difference.The SavjO2 was decreased after ischemic/reperfusion injury in normal thermal,compared with pre ischemic,there are significant differe

9、nce.but there are a little increased SavjO2 in sub-hypothermal treatment, and this increase have no significant difference.Conclusion The local cerebral sub-hypothermal can reduce the IL-1、TNF and increase the IL-10 expression to attenuate the inflammation response after global ischemic/reperfusion

10、injury in rabbits.Key words Cerebral ischemic/reperfusion;sub-hypothermia;cytokine. 脑缺血再灌注后迟发的神经元损伤是颅脑手术术后脑功能障碍的重要原因1。炎症级联反应在缺血再灌注后迟发的神经元损伤中起关键作用。有研究资料表明，亚低温（32-33）对脑组织具有保护作用，能够降低脑细胞的能量代谢，减少有毒物质的释放2。本研究采用兔全脑缺血再灌注模型，观察全脑缺血再灌注损伤后血浆IL-1、TNF、IL-10表达的变化，探讨局部脑组织亚低温对脑缺血再灌注损伤早期炎性反应的影响。为临床合理的脑保护提供理论依据。材 料 与

11、方 法11 动物及分组 健康新西兰大耳白兔24只，由广州医学院实验动物中心提供，体重2.5-3.5kg，雌雄不拘，随机分为正常对照组（组），常温缺血再灌注损伤组（组），亚低温缺血再灌注损伤组（组），每组8只。12 动物模型制作和处理 25g/L戊巴比妥钠（1ml/kg）i.v 麻醉白兔后，仰卧固定于手术台，颈部正中切口，分离双侧颈总动脉及颈静脉，分别用动、静脉穿刺针穿刺，接Simens730监测血压及留置静脉通路，数字监测仪监测鼓膜温度。静脉放血30-40ml，每ml加入1U保存，待血压降至50mmHg时用微动脉血管夹夹闭双侧颈总动脉，缺血30min后松开血管夹，并快速回输所放血入体内。缺血达

12、到以下标准：即夹闭双侧颈总动脉10s左右，兔出现意识丧失，角膜反射和翻正反射消失，并在30min缺血期内，意识和上述反射均未恢复者，方可实施再灌注，在缺血期死亡或仅出现昏睡以及整个实验过程中出现抽搐的兔均被弃去。组动物不作任何处理，组动物在双侧颈总动脉夹闭放血的同时，使用半导体致冷装置行脑部降温，并保持鼓膜温度于32±1并维持恒定。13 标本采集与检测 各组动物持续监测MAP、CVP、鼓膜温度和皮温，于缺血前（T0）、缺血后30min（T1）、再灌注后30min（T2）、 1h（T3） 、2h（T4）、 3h（T5）、 4h（T6）分别采血2ml检测动脉血气，SavjO2。并于上述时

13、间点采颈内静脉血3ml，经10%EDTA抗凝，离心（4600r/min）后取血清，-80保存，采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定IL-1、TNF、IL-10含量。试剂由上海展晨生物公司提供，全自动化学发光酶免测定仪检测，再灌注4h放血处死动物，取大脑半球置于100干燥箱内12h，以干湿重法测定脑水含量。14 统计学处理 用SPSS10.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，组内比较采用配对t检验，P <0.05为差异具有统计学意义。结 果1. 1 常温缺血再灌注损伤后SavjO2下降，与缺血前相比，差异具有显著性，亚低温处理后SavjO2

14、略高于常温缺血组，但两组间相比，差异无显著性。1.2 血清IL-1、TNF、IL-10表达的变化：组血清IL-1、TNF表达明显高于组和组，P <0.05, 组IL-1、TNF表达高于组，但低于组，与组和组相比，差异具有显著性，P <0.05。组血清IL-10表达明显低于组和组，三组间两两相比，差异具有显著性。1.3 脑含水量改变：、组分别为 (82.0±0.4) %、(84.3±0.3) %、(82.3±0.4) %，常温缺血再灌注组高于正常对照组和亚低温组（P <0.05），组和组比较差异无显著性。表1 三组各时间点血浆IL-1、TNF、IL

15、-10含量的比较（±s，pg/ml）组别 缺血前 缺血30min 再灌注30min 60min 120min 180min 283.1±28.7 281.6±26.6 282.6±27.8 281.6±26.6 283.3±26.0 284.0±25.6IL-1 330.7±21.4 829.1±22.4# 827.8±26.3# 1107.8±52.6# 978.9±46.4# 1068.4±48.7# 297.2±20.7 816.9±29.

16、7 413.4±19.4* 375.5±17.2* 356.7±23.1* 385.3±23.3* 443.3±18.9 454.1±21.1 445.3±20.6 446.1±20.4 444.2±19.4 451.1±20.1IL-10 454.2±20.4 244.3±14.6# 338.9±16.6# 341.7±18.4# 356.9±22.4# 375.7±21.5# 448.2±21.4 356.2±2

17、2.8* 474.8±20.5* 476.6±21.3* 478.7±18.8* 467.4±25.6* 54.5±5.8 53.8±6.8 54.1±4.9 54.6±5.6 55.0±3.5 54.6±4.8TNF 54.9±4.4 155.2±5.2# 75.7±3.8# 81.3±4.9# 84.0±4.5# 78.6±6.5# 56.4±4.0 70.2±3.9* 66.4±4.9* 61.7&#

18、177;4.7* 60.6±3.8* 61.4±2.4*与组相比，* P <0.05，与缺血前相比，# P <0.05，# P <0.01讨 论细胞因子在脑缺血再灌注损伤后的继发性炎症反应过程中起相当重要的作用3。当脑缺血发生时，中性粒细胞在缺血区血管内聚集，阻塞微血管，造成不灌注或低灌注现象的出现，同时，被激活的中性粒细胞产生多种炎性递质、细胞因子，如IL-1、IL-8、TNF-等，而此类炎性因子又能诱导ICAM-1、选择素的表达上调，从而导致白细胞聚集、血管渗透压增加、氧自由基产生增多、兴奋性氨基酸释放、白细胞迁移到脑实质等，加重组织坏死而致脑损伤 4

19、。本研究观察到缺血再灌注损伤后血浆IL-1、TNF、IL-10含量的变化，结果表明，缺血再灌注后30min，血浆IL-1、TNF、含量开始逐渐升高， 120min达到高峰，并维持于再灌注后240min。而IL-10的含量则在再灌注后120min降低，并维持至实验结束。而采用局部脑组织亚低温处理后，在脑缺血再灌注损伤早期血清IL-1、TNF表达明显低于缺血再灌注损伤组动物，而IL-10表达也明显高于缺血再灌注损伤组。说明亚低温治疗可通过抑制炎性因子IL-1、TNF的表达，升高IL-10表达从而减轻炎性损伤，而起到脑保护作用。亚低温的脑保护作用在多个研究中也得到证实567。Georges等8研究中

20、可逆性阻断大脑中动脉及双侧颈动脉3h的前脑缺血模型，发现局灶性可逆性脑缺血后亚低温的时间窗，必须在缺血后30min内并且至少维持3h才能发挥亚低温的良好脑保护作用，而其他学者的亚低温脑保护观察多持续至缺血后的24h，因此，本研究中确定的亚低温3h观察时间为终止点，仅对脑缺血再灌注损伤早期炎性反应进行了探讨。Deng等2曾用大鼠制成大脑中动脉栓塞模型，缺血2h立即给予亚低温，结果证实亚低温能明显抑制大鼠局灶性脑缺血再灌注后的白细胞聚集，抑制炎症细胞因子的表达。另有研究报道，低温可诱导热休克蛋白70（HSP70）的表达，导致炎症级联反应变换，减少促炎性介质，增加抗炎性细胞因子IL-10的水平9。I

21、L-10作为体内的重要抗炎因子，它的升高能够抑制其它促炎因子的释放而减轻炎症反应，本研究中亚低温组IL-10的表达增高，而IL-1、TNF表达明显低于缺血再灌注损伤组动物，与上述研究结果基本一致，说明本研究所采用的局部脑组织亚低温能抑制脑缺血再灌注损伤后的炎症反应。 本研究中尚观察了缺血再灌注后SavjO2的变化，发现在亚低温后，SavjO2虽然高于缺血再灌注组但二者差异并无显著性，说明单一SavjO2并不是观察脑灌注损伤的单一有效指标，必须结合其它观察指标。此外，本研究在模型制备过程中采用血管夹闭的基础上放血诱导低血压则使缺血更加完全，可通过脑含水量改变得以体现，在常温缺血再灌注组含水量明显

22、高于正常对照组，说明脑组织水肿更为严重。而亚低温组脑组织含水量与正常对照组相比却无显著差异，说明亚低温能够通过抑制炎性递质释放，降低血脑屏障的通透性、减轻脑水肿而起到脑保护作用。总之，脑缺血再灌注后脑组织的局部过度炎症反应是造成缺血再灌注损伤的重要原因，阻断再灌注后的炎症级联反应是改善缺血后脑损伤的重要手段，采用亚低温治疗可减少脑缺血再灌注损伤时血清IL-1、TNF表达，增加IL-10的表达而起到脑保护作用。参考文献1. Zhang RL，Chopp M，Chen H，et al.Postischemic (1 hour) hypothermia significantly reduces ischemic cell damage in rats subjected to 2 hours of middle cerebral artery occlusion.Stroke,1993,24:1235-1240.2. Deng H,Han HS,Cheng D,et al.3. 吴桂昌，陆雪芬，徐恩. 亚低温对大鼠脑缺血再灌注后