用于乳酸菌分离鉴定的几种培养基的筛选及应用_图文

1、用于乳酸菌分离鉴定的几种培养基的筛选及应用王友湘，陈庆森，阎亚丽（天津市食品生物技术重点实验室，天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津）摘要：发酵乳产品中益生菌活菌数的正确评价，对保障发酵乳制品的质量和功效具有重大意义。本研究通过对三种不同的益生菌在五种不同的培养基上的生长状况进行了评价和观察，结果发现嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌在改良培养基上生长状况很好，瑞士乳杆菌在溴甲酚绿指示剂培养基上长势良好。研究结果为以这些菌种研究开发新型发酵乳产品提供了技术和品质的保证，也为益生菌及益生菌制品深入研究打下了基础。关键词：益生菌；培养基；生物量；活菌数，（，）：，：；中图分类号：文献标识码：文章编号：（）

2、益生菌（）是一类对人和动植物机体有益的微生物，无毒性、无致病作用，能在消化道存活，能适应胃酸和胆盐，能在消化道表面定植，能够产生有用的酶类和代谢物，在加工和贮存过程中能保持活性并且具有良好的感官特性。近些年来，国内外大量的研究证实益生菌具有多种保健功能和生理疗效，所以益生菌制品越来越多的受到人们的重视和研究的热点。国内外对益生菌分离鉴定的研究从最基础利用培养基和指示剂、生化试剂等方法发展到现在应用不依赖纯培养的分子生态学方法及分子工具，比如基因的聚合酶链式反应（，）和荧光原位杂交（，）的应用，表明益生菌分离鉴定的研究已经达到了生物分子学的水平，这些方法尽管通过最基本的方法对不同的益生菌在不同的

3、培养基中的生长状况的研究，以筛选出计数各种益生菌活菌数量的最佳培养基，从而可以客观的反映市售酸奶及一些乳制品中活菌数量的多少，能够更好的评价产品的质量，以有利于益生菌制品的深入研究与开发。材料与方法材料菌种嗜热链球菌（）（号菌）中国工业微生物菌种保藏中心；嗜酸乳杆菌（）（号菌）中国普通微生物菌种保藏中心；瑞士乳杆菌（）（号菌）本实验室。培养基快速、准确性高、能表达分离物间的系统发育关系；但分离鉴定成本较高，推广存在难度等。本实验主要收稿日期：通讯作者作者简介：王友湘（），女，硕士研究生，研究方向为发酵生物技术与生物活性物质。改良培养基（号）：番茄汁；酵母浸粉；牛肉浸膏；乳糖；葡萄糖；琼脂；蒸馏

4、水；±；，灭菌。培养基（号）：大豆胨；蛋白胨；酪蛋白胨；酵母浸粉；牛肉粉；乳糖；抗坏血酸钠；甘油磷酸钠；琼脂；蒸馏水，；，灭菌。溴甲酚绿指示剂培养基（号）：酵母浸膏，琼脂；溴甲酚绿指示剂；蒸馏水；乳清粉；蒸馏水；，灭菌。号培养基的制备是灭菌后在无菌状态下混匀后倒平板。培养基（号）：蛋白胨；牛肉浸粉；酵母浸粉；葡萄糖；柠檬酸氢二铵；琼脂；蒸馏水，±；，灭菌。培养基（号）：酵母浸粉；胰酪蛋白胨；葡萄糖；柠檬酸铵；冰乙酸；蒸馏水，±；，灭菌。素琼脂培养基：琼脂；蒸馏水；，灭菌。方法实验菌种的培养方法首先将已经活化好的三种菌分别以十倍稀释法进行以及细菌个体形的观察，对几种

5、细菌的生长状况进行描述。数据处理实验取得的数据采用分析软件处理，数值均±表示。结果与分析三种乳酸菌在不同培养基上形成的菌落数比较通过十倍稀释法对三种菌在五种培养基上分别培养，然后计算在各种培养基上的菌落数，换算成相应的浓度，然后用进行分析处理，得到表所示的结果。由表可以看出，嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌在改良培养基上菌落数最多，瑞士乳杆菌在溴甲酚绿指示剂培养基上菌落数较多。培养基对瑞士乳杆菌生长而言也是一个较好的培养基，但从鉴定菌落形成单位考虑，溴甲酚绿指示剂培养基要好于培养基。因此后续研究采用的培养基为：嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌为改良培养基，瑞士乳杆菌为溴甲酚绿指示剂培养基。三种乳酸菌在选

6、择培养基上菌落形态的特征根据实验方法中所建立的培养方法和伯杰鉴定手册，实验对三种乳酸菌在不同培养基上生长的状态进行了考察，其结果见表。表中的描述特征和伯杰鉴定手册中所描述的基本上对应，此外，对于各菌的菌体形态都作了镜检，发现它们的菌体形态与伯杰鉴定手册上描述的相对应，表明未出现杂菌污染的情况（图所示）。从表的观测结果可以得出，嗜热链球菌在改良培养基和培养基上菌落较大且菌落颜色比较明显，在溴甲酚绿指示剂培养基上菌落小而模糊。嗜酸乳杆菌虽在五种培养基上都长，但是只有在培养基和伯杰鉴定手册上所描述的菌落状态相同，并且只有在培养基上生长形成的菌落清楚，便于计数，虽然在改良培养基上也很清楚但是相对来说菌

7、落小一些，在其它三种培养基上形成的菌落小且很难分辨。瑞士乳杆菌只在溴甲酚绿指示剂培养基和培养基上生长，在溴甲酚绿指示剂培养基上的菌落较培养基的清晰，容易辨认计数。故通过本实验重复验证，证实三种益生菌可以稀释，然后以倾注法平铺于平板底部，然后倒入已经灭菌并处于保温状态的培养基，迅速摇匀，随后上部铺上一层素琼脂，使之处于厌氧状态进行培养。实验对号、号、号、号培养基培养，号培养基培养，然后分别观察，对比并记录其生长状况。菌落特征的描述方法菌落特特征的描述主要是参照伯杰氏细菌鉴定手册和常见细菌系统鉴定手册，通过菌落形态表各培养基上菌落数(lg CFU/ml(±SDTable 1 Flora

8、of various culture medium(lg CFU/ml(±SD菌种嗜热链球菌嗜酸乳杆菌瑞士乳杆菌培养基改良±±培养基±±指示剂培养基±±±培养基±培养基±±注：在实验平板上看不到菌落或者虽有菌落生长但是达不到菌浓的视为不生长，用“”表示不生长。表微生物在各培养基上的生长状况Table 2 Development of bacteria in various culture media菌种培养基改良菌落白色，圆形扁平，边缘光滑，长在培养基中间的菌落直径且培养基菌落白色，圆

9、形扁平，边缘光滑，长在培养基中间的菌落直径且有的垂直生长，在平皿底部的菌直径。指示剂培养基菌落黄色，长菌的地方培养基由蓝变黄且菌落中间颜色较周围深并呈微透明状，直径边缘模糊。有的也垂直生长，贴壁的直径稍大。菌落乳白，圆形扁平，边缘模糊，长在培养基中间的菌落直径少有垂直生长，在平皿底部的菌直径。菌落黄色，培养基中间的直径透明，贴壁的约，菌落中间颜色深周围围透明，边缘模糊，培养基由兰变黄。菌落白色，培养基中间的呈刺样不规则状，圆形部分直径，垂直生长的较多，贴壁菌落直径边缘光滑且中间以颜色更深的小点，培养基变黄。菌落黄色，培养基中间的菌落直径扁菌落乳白，透明状，颜色很浅，边缘模糊，直径约，贴壁生长的

10、稍大，无垂直生长。菌落乳白，透明，边缘模糊，直径约，菌落颜色很浅，无垂直生长，贴壁生长的稍大一点。培养基培养基嗜热链球菌有的垂直生长，在平皿底部的菌直径，培养基由浅黄变得稍深。菌落白色，圆形扁平，边缘光滑，长在培养基中间的嗜酸乳杆菌菌落直径且有的垂直生长，在平皿底部的菌直径，培养基由浅黄变得稍深。瑞士乳杆菌平边缘光滑，贴壁的约中间颜色深周围透明边缘模糊，培养基由兰变黄。注：在实验平板上不生长或生长但达不到菌浓的视为无生长状况，用“”表示生长状况 。分别利用其在不同培养基上的生长状况进行分离筛选或者是混合发酵菌落计数，为益生菌的进一步研究和生产应用打下基础。验证实验基于本实验的研究结果，我们对所

11、建立的几种培养基分离鉴定发酵乳中乳酸菌的实际应用进行了验证实验。将溴甲酚绿指示剂培养基用于瑞士乳杆菌研制抑制肽酸奶生产时活菌计数；用改良培养基和培养基用于嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌混合发酵条件的研究试验，验证结果见图所示。由图可以直观的看出，几种益生菌的生长情况和菌落状况，瑞士乳杆菌的菌落清晰可见，可以获得满意的实验结果；而对嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌的混合菌的分离鉴定中，嗜酸乳杆菌菌落较嗜热链球菌大，并且两种菌混合培养时，都可以清晰地看出两种菌落，也可以得到很好的分离鉴定的实验结果。实验结果证实，采用该法对发酵乳中几种益生菌分离鉴定，特别是对其活菌数的评价是可行的，也对发酵乳产品的传统方法的活菌检测

12、提供了一种有效的技术方法。讨论从我们所检索收集的大量文献可以看出，含有益生菌的发酵乳产品通常存在生物量（即）和产品质量难以评价的现象。比如在国内外的一些报道中，对于嗜酸瑞士乳杆菌 嗜酸乳杆 菌图各种菌的镜检图(×40Fig.1 Three kinds of bacteria microscopy(×40嗜热链球菌瑞士乳杆菌在溴甲酚绿指嗜酸乳杆菌在上的生长状 态示剂培养基上的生长状态嗜酸乳杆菌在改良上的的生嗜酸链球菌在改良上的的生长状态长状 态嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌混合菌在改良上的的生长状态图三种菌各自最适应培养基上的生状况Fig.2 Three kinds of bacte

13、ria grow in their optimal media乳杆菌和嗜热链球菌的共生特性有一定的研究，也已经开始应用于发酵酸奶的生产。但是对于在发酵酸奶活菌计数中往往会出现在两种鉴别培养基交叉生长的现象，或者是培养基选择不当造成菌落计数和实际数量之间的误差过大造成难以很好的评价酸奶的质量的问题。再比如对于瑞士乳杆菌，一直以来瑞士乳杆菌的计数问题都是比较困难的事情，虽然有报道中提到用培养基或者是培养基，但是据本实验观察发现在此两种培养基上虽然可以生长，但是生长的数量与实际数量存在较大的误差。还有在对各种益生菌酸奶的活菌计数的条件方面也存在一定的困难，因乳酸菌类的细菌均属于兼性厌氧菌，但更适宜在

14、严格厌氧的条件下生长的细菌，所以在实验室建立一种常规、经济、简单且可行的培养环境条件是非常必要。通过我们的大量试验性探索和尝试，获得了一些在常规简易的条件下分离鉴定益生菌酸奶中活菌计数的研究成果，首先尝试建立了一种厌氧菌的双层倾注法，上层为素琼脂，下层是待分离鉴定的细菌，目的是保证在厌氧条件下被分离细菌处于良好的生长环境，该条件在本研究中得到了很好的实践，并取得了可靠的试验结果。其次嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌作为混合发酵剂的分离鉴定的研究，由于两者细菌存在着良好的共生关系，则生产上常按一定比列混合用于酸奶的发酵。那么如何评价该类型的发酵型酸乳制品的品质，特别是在计算活菌数方面，就难免会遇到在同一种

15、培养基上一种细菌生长旺盛而另一种细菌生长的差的问题，这就给活菌计数带来麻烦。本实验选择出几种培养基，结合表表我们可以看出，虽然前三种培养基都可以用来计算活菌数，但是改良培养基不管从总的菌落数还是从菌落生长状况看都是最适合用来计数的。另外，在分别平板计数活菌数方面，结合我们的实验结果可以看到，嗜酸乳杆菌在培养基上生长状况更好一些，菌落数也较多，所以适合嗜酸乳杆菌的计数。本研究的大量实验证实，在该类型细菌的质量评价方面，可以先用改良培养基鉴定其总数，再用培养基计数嗜酸乳杆菌的数量，从而就可以得到总的活菌数以及各自的菌落数。在众多的乳酸菌中，瑞士乳杆菌是近些年来人们关注的重要人体肠道的益生菌。该菌可

16、分离自酸乳、制干酪的引子和干酪，同型发酵所产生乳酸食用是安全的；另外，瑞士乳杆菌还表现较强的蛋白水解活性，能水解乳蛋白产生多种具有免疫活性的物质。本实验室所用的瑞士乳杆菌具有很强的蛋白酶活力，故在功能性发酵乳的生产方面表现出很好的开发潜力。在我们对瑞士乳杆菌的大量研究中发现，该菌在乳清粉中生长旺盛，但在该斜面及其他常用的培养基和斜面上几乎不长。采用本实验的方法成功的解决了计数困难和菌种保藏的问题，为瑞士乳杆菌的进一步研究打下基础。结合两表可以得出溴甲酚绿指示剂培养基上该菌的生长最佳，而且菌落清晰较大，而培养基上的菌落颜色浅不易辨认，所以选择溴甲酚绿指示剂培养基更适合瑞士乳杆菌计数和保藏。结论通

17、过本研究建立了一种在厌氧的条件下分离鉴定益生菌的双层倾注活菌计数方法，计数的准确性优于目前文献报道的方法。筛选确定了三种乳酸菌的培养基，特别是为在实际的科学研究或生产中提供简易、经济可行的分离鉴定的试验方法和经验。在嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌混合菌青稞酒曲中酿酒酵母与假丝酵母原生质体形成与再生条件的研究，杜木英，陈娟，阚建全，陈宗道（西南大学食品科学学院，重庆；，）摘要：本实验通过研究酶种类、菌龄、酶浓度及酶的作用时间、菌体预处理及渗透压稳定剂等不同因素对原生质体形成与再生的影响，得出了青稞酒曲酵母，原生质体制备和再生的最佳条件：酵母在菌龄为，巯基乙醇为预处理剂作用；下用的蜗牛酶酶解；酵母在菌龄为

18、，硫苏糖醇混合于蜗牛酶溶壁酶的酶解体系中，下酶解；配制酶解液时渗透压稳定剂采用，在稀释及配制再生培养基时采用蔗糖的条件下，酵母形成率达，再生率达；酵母形成率达，再生率达。关键词：青稞酒曲；酿酒酵母；假丝酵母；原生质体制备；原生质体再生，（，；，）：，收稿日期：通讯作者基金项目：科技部年度中国与匈牙利政府间科技合作项目（）作者简介：杜木英（），女，副教授，在职博士研究生，主要从事工业微生物与发酵工程技术研究。种发酵酸奶制品的分离鉴定中，先用改良培养基鉴定其总菌数，再用培养基计数嗜酸乳杆菌的数量，得到总的活菌数以及各自的菌落数。对瑞士乳杆菌的分离鉴定，使用溴甲酚绿指示剂培养基即可得到满意的结果。参考文献：潘宝海，李德发，谯仕彦益生菌、益生素及合生剂的作用机理和相互关系中国饲料，：李继秋，谭北平，麦康森，等一株水产益生菌的鉴定中国海洋大学学报，（）：凌代文乳酸细菌分类鉴定及实验方法北京：中国轻工业出版社