17β雌二醇对胃粘膜细胞系GES1中ERα蛋白表达影响

1、17 &雌二醇对胃粘膜细胞系 GES-1中ER-a蛋白表达的影响6张尚昆（江汉大学医学院病理学与病理生理学教研室湖北武汉430056）摘要：观察不同浓度雌二醇处理不同时间的情况下，人正常胃粘膜细胞系GES-1中ER-a蛋白表达量的变化，探讨正常胃粘膜细胞中雌激素对 ER-a蛋白表达 可能存在的影响.方法：GES-1 细胞经 5X10-6mol/L、5X10-8mol/L、10-12mol/L 和 10-14mol/L 的 17 &雌二醇（17 -estradiol, E2）处理 24h,应用 Western Blot 及灰 度分析的方法检测蛋白表达量的改变，平均光密度值采用 t

2、检验分析。关键词：雌激素；ER-a;正常胃黏膜细胞系胃癌是中国常见恶性肿瘤之一"，其男女发病率为2： 1。Sipponen等发现 女性胃癌发生时间较男性推迟10-15年，绝经期后发病率与男性相近'2。经典的雌激素受体 a （estrogen receptor ,aER- a，又称 ER- a 66在胃癌中表达率远 较乳腺癌低（2%-28%），长期以来胃癌被认为是非雌激素依赖性肿瘤。近期 研究发现，选择性雌激素受体调节剂他莫昔芬（Tamoxifen，TAM ）与胃癌的发生有关2，雌激素在多种传统意义上的非雌激素依赖肿瘤中发挥重要作用 I刀，但是，雌激素对正常胃细胞系是否也有影响

3、的研究尚不清楚。ER- a 3是 2005年发现的独立存在的ER- a 66的同源异构体。其在乳腺癌中 被证明与乳腺癌细胞的生长相关，尤其是在ER-a阴性的乳腺癌中发挥重要作用，并已经发现ER- a 36寸ER- a 6« ER- B具有抑制作用'2'。ER- a 36®胃癌中 的表达情况和生物学作用未见报道。来自我们的前期研究发现，人胃癌组织中 存在ER-a 36分子表达（mRNA和蛋白质），并且癌组织中表达量高于癌旁组 织及正常组织，胃癌组织及胃癌细胞株中ER- a 36的表达高于 ER- a 66胃癌ER- a 36mRNAS达与胃癌淋巴结转移相关3&

4、#39;。A B3 iTo"1冃癌近年来研究发现，胃癌与雌激素以及雌激素受体有关。在胃癌组织中检测出了雌激素受体的存在。王陆佰等'8采用实时荧光定量RT-PCR方法检测了 4 株胃癌细胞 AGS、BGC-823、MKN-45、SGC-7901 中 ER- o36和 ER- a 66hRNA 的表达情况；采用半定量 RT-PCR方法检测20例人胃腺癌组织中肿块、癌旁组 织及正常组织中的 ER- a 36和ER- o66mRNA表达情况。结果显示：ER- c36和 ER-a 66勺mRNA在胃癌细胞株和人体胃癌样本中均有表达。胃癌细胞株中ER-036 表达量高于 ER- o66;

5、人体样本中 ER-a6在正常组织表达量最高，ER- o36 在癌组织中表达量最高，且与患者的年龄、肿瘤的大小、组织学分级以及淋巴 结转移相关。研究结果显示：ER- «36在胃癌细胞中发挥的作用可能大于ERa 66 ER- o36mRNA的高表达与胃癌的生物学行为相关。2雌激素受体ER- a的生物学效应初步研究的结果发现，ER- «36具有细胞因子的作用，在细胞的生长与凋亡 中发挥重要作用。传统的雌激素受体 ER-(66为核受体，主要分布在细胞核中， 属于核受体超家族成员，由配体激活存在于核内的转录因子，行使其生物学效 应。通过成骨细胞膜实验验证，与经典的雌激素受体ER- &

6、#171;66不同，ER- 636为膜受体I，大量分布于细胞膜的表面，接收来自细胞外和细胞内的信号转导。作 为膜受体的ER- 636在生理、病理过程中发挥了与经典ER- 036不同的生物学效应。一般情况下，它可以介导细胞信号传导通路，在细胞的内外信息交流中发 挥重要作用。研究显示，ER- 03既可以被雌激素激活，又可以被抗雌激素激活，通过Caveolin-1介导的MAPK信号通路的激活促进乳腺癌细胞增殖 1 Caveoli n-1单倍不足可以促进正常乳腺细胞的早期转化111】，其机制与ER-66介导的PI3 K/AKT信号通路的激活有关1;雌激素受体ER- 636参与了子宫内 膜癌中睾酮诱导的

7、细胞增殖信号通路的调节1此外，雌激素受体ER- 636在肝癌和胃癌信号通路调节中亦发挥着重要的生理学作用。由于这种新型的雌激 素受体在机体中各个器官的分布以及调节作用与传统的雌激素受体ER- 636具有一定的差异性，因此，值得我们更进一步地研究和探讨。3 ER-a在胃癌细胞中的表达雌激素(estrogen, E)是一种由内分泌系统产生的类固醇性激素，雌激素与 其靶器官乳腺等组织的肿瘤发生密切相关13。雌激素通过与雌激素受体(estrogen receptor，ER)的结合，传递细胞生长的信号，对靶器官组织的肿瘤形 成产生影响。近年来的研究发现，雌激素及雌激素介导的信号转导通路在非雌 激素依赖的

8、肿瘤如肺癌、膀胱癌及大肠癌等的发生中具有非常重要的作用 胃癌中雌激素及雌激素受体作用机制的研究，虽起步较早但一直未取得突破性 进展。雌激素及雌激素受体在胃癌发生与发展、侵袭与转移中是否存在并发挥何 种作用，相关研究仍无定论。早期的研究认为，ER表达水平与胃癌病人的肿瘤大小、性别、年龄无明显关系15 目前研究多认为，ER阳性的胃癌多为低分 化，伴有淋巴结转移及浆膜侵犯，生物学行为不良，预后不佳1。国内赵新汉等应用原位杂交技术发现ER mRNA较ER蛋白有更高的阳性表达，且多集中于 管状腺癌、低分化腺癌、印戒细胞癌，ER mRNA的表达与胃癌生物学特征密切相关。Takanoa1等发现，胃癌组织中

9、ER-u mRNA阳性表达率为51%, ER- 沖RNA阳性表达率为 73%;而在正常胃组织，ER- 6mRNA阳性表达率为37%，ER-师RNA阳性表达率为88%，且二者的表达变化和胃癌的转移密切相 关。ER- 636是最早发现的雌激素受体-6亚型(即传统观念的ER-6，已有研究发 现在那些对雌激素敏感的细胞的增殖过程中，ER- 636可以起到活化促进生长基因表达的重要作用 。ER-636是王兆一等在2005年克隆并发现的雌激素受体- 6的新亚型，分子质量为 35.7kU，经过基因序列的测定、克隆技术和蛋白质技 术的证实后，将该蛋白质命名为 ER- a 3沪。与ER-a6相比，ER- o36

10、'厂缺少 AF-1和AF-2两个转录功能激活域，其主要定位于细胞膜，通过膜雌激素受体 介导快速信号转导通路，产生各种生物学效应，并与肿瘤细胞的分化、增殖及 凋亡等有密切关系。4雌激素的生长调节作用当前仍存在争议。Harris on等报道，雌激素不能调节胃癌细胞系的生长，而 近期观点认为，雌激素能促进胃癌生长 '13'。本项研究发现E2阿促进胃癌细胞 生长，在10-10, 10-11和10-12mol/L时，随着E2 3浓度的降低生长速度加快。该现象 与绝经前期女性（生理状态下高雌激素水平）胃癌发病率较男性胃癌低，绝经 期后这种差异消失的临床特点具有一致性 R。本研究首先

11、使用无酚红培养基处 理细胞以去除细胞培养过程中酚红的类雌激素作用，然后，使用1%的活性炭处理的胎牛血清进行胃癌细胞培养，以降低其他生长激素对细胞生长的影响，在 此基础之上，给予不同浓度的E2 0处理细胞可以准确的反映雌激素对细胞生长的 作用效果。结果发现，雌激素确有促进细胞生长的效应，且与雌激素的浓度有 关。据此推测，E2 可促进胃癌细胞生长。ER-a 3是2005年发现的ER-a的同源异构体'2'。其蛋白分子质量为36 kU,基因结构特征为：缺少转录激活域 AF1和部分AF2，但保留有DNA结合 域、部分二聚化域和部分配体结合域，启动子与ER-a 66完全不同，并具有17个氨

12、基酸长度的特征性序列。ER- a 36在胃癌细胞中的表达及生物学作用尚无文 献报告。本项研究在不同E2B处理条件下，观察了 ER- a 3基因和蛋白质水 平的表达变化。在mRNA水平，给予不同浓度的E2 B处理，ER-a 36勺表达量均 较未处理组增高，并有浓度依赖效应。而在蛋白质水平，ER-a 36勺表达变化与mRNA水平并非有完全一致的关系。表现为 ER- a 3蛋白的表达量与E2 B浓度呈 现依赖效应，但在24h时，ER-a 36S白的表达量高于未处理组，而 48h时则均 低于未处理组。其结果显示，给予雌激素作用后，胃癌细胞的ER-a 36 mRNA水平呈现持续的增加（24h和48h），

13、而ER-a 368白质的表达量则出现先上升 （24h）后下降（48h）的变化趋势。据此我们推测，雌激素可能通过调控位于 细胞膜上的ER- a 36分子，介导了细胞内的效应，E2-ER- a 36途径在胃癌生长调 控中可能发挥重要作用。基于ER-a 36在乳腺癌和结直肠癌中的生物学作用和相关作用机制的研究， 我们前期的工作发现，并结合上述的实验结果提示，ER- a 3鲂子可能在雌激素介导的胃癌细胞生长中发挥比 ER-a 66g为重要的作用'仮。首先，在无雌激素 培养背景和雌激素处理的情况下，E2 P处理24h时，ER- a 3在 mRNA和蛋白表 达水平上随着雌激素浓度的升高而增高，说明

14、E2 B对胃癌细胞的促生长作用是通过ER-a 36实现的，且胃癌细胞中存在转录水平对 ER-a 3盼子的调控'其 次，在E2 B处理48h时，虽然ER- a 3在 mRNA和蛋白质水平表达量仍与 E2 p 浓度变化一致，但蛋白表达量却明显降低，说明随着雌激素作用时间延长，胃 癌细胞可能在翻译水平对ER-a 3涪在调控，其具体机制有待进一步证实'16。5结束语本项研究通过使用不同浓度的17B雌二醇(17Bestradiol, E2)对人正常胃 粘膜细胞株GES-1进行处理，观察胃黏膜细胞ER-0蛋白水平的变化，探讨雌激 素对胃正常细胞可能存在的调控作用。参考文献123吴春晓，郑莹

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