慢病毒载体包装构建过程

1、:17X；9*4I4rffltirf4rw Aifocstfridi玉、IN 叩；'： j助T下*经!WUDtr*n vnfimfcr j if 组织，订 0円慢病毒载体包装构建过程 原理：慢病毒载体可以将外源基因或外源的 shRNA有效地整合到宿主 染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。 在感染能力方面可 有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、 干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。 对于一 些较难转染的细胞， 如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用 慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA勺转导效率，且目的 基因或目的shRNA整

2、合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较 方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。殆4Vlffl mRNAShRMA:d：RISCit LI概念：慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1 (H IV-1)来源的一种 病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信 息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。 携带有外源基因的慢病毒载 体在慢病毒包装质粒、细胞系的1 的病毒颗粒，通过感染细胞或活体 组织中表达。辅助成分：慢病毒载体辅助成分包括： 慢病毒包装质粒和可产生病 毒颗粒的细胞系。慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒 包装质粒可提供所有的转录并包

3、装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。 为产生高滴度的病毒颗粒， 需要利用表达载体和包 装质粒同时共转染细胞， 在细胞中进行病毒的包装， 包装好的假病毒 颗粒分泌到细胞外的培养基中， 离心取得上清液后， 可以直接用于宿 主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到 基因组，从而高水平的表达效应分子。基本原理：慢病毒载体系统由两部分组成，即包装成分和载体成分。包装成分：由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作 用序列而构建， 能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白。 包装成分 通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一 个质粒表达Env

4、蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。将包装成分与载体成分的3个质粒共转染细胞（如人肾293T细胞），即 可在细胞上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、 携带目的 基因的 HIV-1 载体颗粒。载体成分：与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的 HIV 顺式作用序列， 同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点 插入的目的基因。为降低两种成分同源重组恢复成野生型病毒的可能，需尽量减少二者 的同源性，如将包装成分上5 LTR换成巨细胞病毒（CMV立即早期启 动子、3 LTR换成 SV40 polyA 等。一、实验流程（1和2为并列步骤）1. 慢病毒过表达质粒载体的构建设计上

5、下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR采用高保真KOE酶，3K内突变率为0%从模板中（CDN巔粒或者文库）调取目的 基因CDSE（ coding sequenee ）连入T载体。将CDS区从T载体上 切下，装入慢病毒过表达质粒载体。2. 慢病毒干扰质粒载体的构建合成siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体3慢病毒载体的包装与浓缩纯化制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别 进行高纯度无内毒素抽提，共转染 293T细胞，转染后6 h更换为完 全培养基，培养24和48h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒 二、实验材料慢

6、病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G, pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-shRNA2 其中质粒上的 ZsGreen1 表达框 能表达绿色荧光蛋白（GFP。载体信息1）慢病毒克隆载体图谱如下：pLVXJRES-ZsGro&nl Vector Information2801 GTGAATTCCT CGAGACTAGT TCTAGAGCGG CCGCGGATCC cacttaagqa gctctgatca agatqtcgcc ggcgcctagg5' LTRRREpUCoripLVX-shRNA27881 bpcPPTCTS Bglll(5072 BgllJ ?K(45653' LTfiXX -MCSP"WPREZsGrHHril2431 AAGGACGAGG ATCCGGA.CAAttccgctcc taggcctgttIkyRrGCTTCGAATT CTAGTTATTAJGAAGUTTAA GATCGCCCAT2）包装质粒信息如下:PMD2载体图谱和序列信息PSPAX载体图谱和序列信息：细胞株293T，慢病毒的包装细