叶绿体色素的提取分离理化性质和叶绿素含量的测定

1、实验报告!课程名称：植物生理学及实验（甲）实验类型：+I-i实验名称：叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定jl+:姓名：*专业：学号：jl1同组学生姓名：指导老师：+装实验地点：实验日期:订一、实验目的和要求 线r二、实验内容和原理i三、主要仪器设备卜四、操作方法与实验步骤+1五、实验数据记录和处理六、实验结果与分析七、讨论、心得一、实验目的和要求1、掌握植物中叶绿体色素的分离和性质鉴定、定量分析的原理和方法。2、熟悉在未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素 a和b的方法及其计算。二、实验内容和原理以青菜为材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量分析。原理如下:1、

2、叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂，常用95%勺乙醇或80%勺丙酮提取。2、皂化反应。叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应，形成绿色的可溶性叶绿素盐，就可与 有机溶剂中的类胡萝卜素分开。COOGHCOOMoONMg + 2KOH C32H30ON4Mg + 2KOH +CH3OH +C20H39OHCOOCHkCOO3、 取代反应。 在酸性或加温条件下，叶绿素卟啉环中的 Mg+可依次被H+和Cu+取 代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素。(H+取代Mg2+, Cu2+ (Zn2+)取代H+ )褐色绿色4、叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。5、 定量分析。叶绿素吸收红光和

3、兰紫光，红光区可用于定量分析，其中645和663用 于定量叶绿素a,b及总量，而652可直接用于总量分析。根据朗伯-比尔定律，最大吸收光谱不同的两个组分的混合液，它们的浓度C与吸光值之间有如下的关系： OD=Ca*ka1+G*k b1 OD=Ca*ka2+G*k b2查阅文献得，叶绿素a和b的80%丙酮溶液，当浓度为1g/L时，比吸收系数k值如 下。波长/nm比吸收系数k叶绿素a叶绿素b663645将数值代入式子得：OD663=*Ca+*Cb OD645=*Ca+*Cb经整理后，得至 V式子：Ca= OD663 - OD645 Cb= OD645 - OD663三、主要仪器设备天平（万分之一）

4、、可扫描分光光度计、离心机、研具、各种容（量）器、洒精灯等四、操作方法与实验步骤1、定性分析：鲜叶5g+95%30ml（逐步加入），磨成匀浆，过滤入三角瓶中，观察荧光现象。皂化反应（3ml）:力卩KOF数片剧烈摇均，加石油醚5ml和H2O 1ml分层后观察取代反应（1）：加醋酸约2ml，取1/2加醋酸铜粉加热。观察颜色变化。取代反应（2）：鲜叶2-3cm2,加Ac-AcCu 20ml加热。2、叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱测定：皂化反应的上层黄色石油醚溶液一稀释（470nm OD）反复用石油醚粹取,直到无类胡萝卜素,离心得叶绿素（盐）一稀释（663nm OD）两者在400-700nm处扫描光谱，

5、分别测定类胡萝卜素和叶绿素的吸收峰3、叶绿素定量分析：鲜叶，加，磨成匀浆，各取加 80%5酮,摇匀，4000转离心3min,上清液在645，652, 663测定OD计算Chla,Chlb 和Chi总量的值。五、实验数据记录和处理1、定性分析：观察荧光现象，透射光为绿色，反射光为红褐色光。皂化反应 （3ml） ：上层呈黄色，为类胡萝卜素，吸收蓝紫光。下层呈绿色，为叶绿素， 吸收红光和蓝紫光。取代反应（1）：加醋酸约2ml，变褐（去镁叶绿素），取1/2加醋酸铜粉加热变绿色， 为铜代叶绿素。2、叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱测定：图 1 图 2图一在420nm左右及690nm左右波长处吸收光谱出现峰值

6、，两者分别位于蓝紫光和红 光的波长范围内，根据叶绿素吸收蓝紫光和红光的特性，可以推测图一是叶绿素的吸收光 谱。图二在450nm以及475nm波长处吸收光谱出现峰值，都位于蓝紫光的波长范围内，根 据类胡萝卜素吸收蓝紫光的特性，可以推测图二是类胡萝卜素的吸收光谱。3、叶绿素定量分析：将数值代入式子，计算得:Ca(mg/L)= 波长/nm mg/L645652663Cb (mg/L)=OD645=*OD663=*mg/LOD 第一组CT (mg/L)=第二组mg/L平均Chia 含量Ca+ Cb =(mg/=(Ca(mg/L)/1000)*2/ *5/ = mg/Chlb 含量(mg/ =( Cb(

7、mg/L)/1000)*2/ *5/ = mg/Chl 总含量(mg/ =( CT(mg/L)/1000)*2/ *5/ =六、实验结果与分析1、定性实验中，各组实验观测是颜色变化基本相同，区别只是颜色的深浅，与研磨时 加入的叶片量、研磨的程度等因素有关。2、 从定量实验所得数据的计算结果来看， 实验所用的叶片中，叶绿素a的含量大约是 叶绿素b的三倍左右。3、邻组所得实验数据与我们的数据有一定差距， 分析可能是以下几个原因造成的：1.研磨的充分程度不同2.所取叶片位置不同，导致叶绿素含量有所区别七、讨论、心得1、为什么叶绿素吸收红光和兰紫光？叶绿素有基态（G）,第一单线激发态（E1）和第二单线激发态（E2）及第三线态（E3）, 光子吸收必须遵守普朗克定律。被吸收光子能量必须等于激发态和基态的能量差。蓝紫光 能量大，可使叶绿素分子中的电子跃迁到 E2,而红光能量小，只能使其跃迁到 E1,故叶绿 素只能吸收蓝紫光和红光。2、为什么可用皂化后的叶绿素盐来测定叶绿素的吸收光谱？因为由于