酶耦合研究进展

1、 酶耦合的研究进展酶耦合的研究进展Page 2 内内 容容u 酶耦合的研究背景酶耦合的研究背景u 酶耦合的定义酶耦合的定义u酶耦合的分类酶耦合的分类u酶耦合的应用研究进展酶耦合的应用研究进展Page 3一、酶耦合的研究背景一、酶耦合的研究背景n 酶应用的发展背景酶应用的发展背景 自从人类发现酶具有高效的催化活性以来，就不断的研究酶的结自从人类发现酶具有高效的催化活性以来，就不断的研究酶的结构、作用机理、并试图进一步对酶进行改善以获得更高的催化活性，构、作用机理、并试图进一步对酶进行改善以获得更高的催化活性，其中的技术包括酶的修饰、酶的定向进化、甚至是人工合成所需酶类，其中的技术包括酶的修饰、酶

2、的定向进化、甚至是人工合成所需酶类，而酶的固定化也由此而因应而生。但这些技术只仅仅集中于单个酶分而酶的固定化也由此而因应而生。但这些技术只仅仅集中于单个酶分子的基础上，并且在运用上也不断暴露一些问题，因此有得学者逐渐子的基础上，并且在运用上也不断暴露一些问题，因此有得学者逐渐开始着眼于酶耦合技术方面上，起初研究是有关酶固定化技术的耦合，开始着眼于酶耦合技术方面上，起初研究是有关酶固定化技术的耦合，而最近人们也开始尝试将两种或两种以上的酶耦合进行催化，另外有而最近人们也开始尝试将两种或两种以上的酶耦合进行催化，另外有得学者将酶耦合的概念延伸，将酶与化学、酶与发酵等进行耦合应用，得学者将酶耦合的概

3、念延伸，将酶与化学、酶与发酵等进行耦合应用，拓展了酶耦合的应用范围，酶耦合概念的提出和应用不仅解决了单酶拓展了酶耦合的应用范围，酶耦合概念的提出和应用不仅解决了单酶催化的一些局限性问题，更在手性分子的拆分，生物转化的应用领域催化的一些局限性问题，更在手性分子的拆分，生物转化的应用领域上取得良好进展，同时也简化了生产工序，提高了生产效率。上取得良好进展，同时也简化了生产工序，提高了生产效率。Page 4n 政治背景政治背景 国家在十二五规划文件中的有关中国生物技术核心关键技术方面提国家在十二五规划文件中的有关中国生物技术核心关键技术方面提出要大力开展出要大力开展多酶耦合、酶与化学耦合、酶与发酵耦

4、合多酶耦合、酶与化学耦合、酶与发酵耦合等关键技术研等关键技术研究，建立具有自主知识产权、成本低、可工业化生产的生物催化工程究，建立具有自主知识产权、成本低、可工业化生产的生物催化工程技术，提高我国工业酶开发和应用水平。（中商情报网技术，提高我国工业酶开发和应用水平。（中商情报网 ，十二五期，十二五期间中国生物技术核心关键技术发展重点）间中国生物技术核心关键技术发展重点）Page 5二、酶耦合的定义二、酶耦合的定义n 耦合：耦合： 指两个或两个以上的电路元件或电网络的输入与输出之间存在紧指两个或两个以上的电路元件或电网络的输入与输出之间存在紧密配合与相互影响，并通过相互作用从一侧向另一侧传输能量

5、的现象；密配合与相互影响，并通过相互作用从一侧向另一侧传输能量的现象；概括的说耦合就是指两个或两个以上的实体相互依赖于对方的一个量概括的说耦合就是指两个或两个以上的实体相互依赖于对方的一个量度。其一般用在通讯、软件等工程方面。度。其一般用在通讯、软件等工程方面。n 酶耦合：酶耦合： 狭义上是指将狭义上是指将两种或两种以上的酶两种或两种以上的酶通过固定化技术或其他方法进通过固定化技术或其他方法进行行联合应用联合应用，或一种酶与另一种非酶物质的联合应用，以改变单酶催，或一种酶与另一种非酶物质的联合应用，以改变单酶催化低效率问题，同时增加其他反应功能，以提高反应作用，而广义上化低效率问题，同时增加其

6、他反应功能，以提高反应作用，而广义上还包括酶和化学、发酵的联合以简化工艺、酶的不同固定化技术之间还包括酶和化学、发酵的联合以简化工艺、酶的不同固定化技术之间的耦合以解决酶和载体结合不牢固，容易脱落等问题的一种技术。的耦合以解决酶和载体结合不牢固，容易脱落等问题的一种技术。Page 6三、三、酶耦合的分类酶耦合的分类n 酶固定化技术的耦合酶固定化技术的耦合（1）吸附吸附- 交联交联 吸附载体富含氨基或羟基，酶通过物理吸附或离子吸附作用与吸附载体富含氨基或羟基，酶通过物理吸附或离子吸附作用与 载体结合，结合力比较弱，在高离子强度和高载体结合，结合力比较弱，在高离子强度和高p H值下，容易解析造值下

7、，容易解析造成酶的泄漏，一般不单独使用。吸附成酶的泄漏，一般不单独使用。吸附- 交联法是目前使用较多的耦合交联法是目前使用较多的耦合方法。方法。 Vemuri G 等研究发现蛋壳吸附，戊二醛交联固定化脂肪酶的等研究发现蛋壳吸附，戊二醛交联固定化脂肪酶的方法机械强度好，能够抵挡较强的剪切力，比方法机械强度好，能够抵挡较强的剪切力，比海藻酸包埋法更适合于海藻酸包埋法更适合于催化搅拌罐中的油脂反应催化搅拌罐中的油脂反应，能重复使用，能重复使用8 批次。吸附介质和一些添加批次。吸附介质和一些添加剂对酶有保护作用，能够降低交联的激烈程度剂对酶有保护作用，能够降低交联的激烈程度. 邱广亮等研究了磁性载体的

8、吸附邱广亮等研究了磁性载体的吸附- 交联法固定酶的方法，磁性载交联法固定酶的方法，磁性载体具有两亲性，适用于水相和有机相系统，并可通过体具有两亲性，适用于水相和有机相系统，并可通过简单的磁场作用简单的磁场作用力实现酶的回收力实现酶的回收。戊二醛交联增强了磁性载体的耐热、酸、碱性，同。戊二醛交联增强了磁性载体的耐热、酸、碱性，同时存储稳定性和操作稳定性也有所增强。时存储稳定性和操作稳定性也有所增强。Page 7（2）共价结合）共价结合-交联交联 共价结合法一般通过载体表面的基团与酶表面的基团如：氨基、共价结合法一般通过载体表面的基团与酶表面的基团如：氨基、羧基、巯基等相互作用实现固定化，结合比较

9、牢固，基团之间有很强羧基、巯基等相互作用实现固定化，结合比较牢固，基团之间有很强的选择性，的选择性， Hung Tien- Chieh 等介绍了以壳聚糖为载体固定化脂肪酶的方等介绍了以壳聚糖为载体固定化脂肪酶的方法，首先用碳化二亚胺激活壳聚糖上的羟基，使酶法，首先用碳化二亚胺激活壳聚糖上的羟基，使酶共价共价结合到羟基上，结合到羟基上，再通过戊二醛在壳聚糖的氨基上再通过戊二醛在壳聚糖的氨基上交联交联更多的酶，该固定化方法又称更多的酶，该固定化方法又称“二元固定化法二元固定化法”。 共价结合共价结合- 交联法也存在一些交联法也存在一些缺点缺点，如操作比较复杂，需要对载，如操作比较复杂，需要对载体进

10、行修饰和活化，酶和载体结合过程中反应激烈，体进行修饰和活化，酶和载体结合过程中反应激烈，容易造成酶失活，容易造成酶失活，如如 Leontievsky A A等在研究中发现，用共价结合等在研究中发现，用共价结合- 交联法固定化漆交联法固定化漆酶，虽然能够维持原有酶活力酶，虽然能够维持原有酶活力33 天，但造成的酶活力损失可达天，但造成的酶活力损失可达50 %。Page 8（3）包埋固定化与其他方法的耦合）包埋固定化与其他方法的耦合 包埋法是固定化酶比较方便的方法，条件温和，基本上不会改包埋法是固定化酶比较方便的方法，条件温和，基本上不会改变酶的结构，细胞也不容易脱落，但主要存在机械强度差、酶易泄

11、漏变酶的结构，细胞也不容易脱落，但主要存在机械强度差、酶易泄漏和传质阻力较大。耦合固定化技术能够很好地解决这两个问题，和传质阻力较大。耦合固定化技术能够很好地解决这两个问题， 王康等用海藻酸钠和壳聚糖固定化脂肪酶，将其应用于有机相的王康等用海藻酸钠和壳聚糖固定化脂肪酶，将其应用于有机相的反应，提高固定化酶的包埋率和稳定性，并且由于壳聚糖具有一定的反应，提高固定化酶的包埋率和稳定性，并且由于壳聚糖具有一定的疏水特性，这有利于疏水底物向酶分子周围的扩散，疏水特性，这有利于疏水底物向酶分子周围的扩散， Tanriseven Aziz 等将葡萄糖淀粉酶等将葡萄糖淀粉酶吸附吸附在凝胶化的玉米淀粉颗在凝胶

12、化的玉米淀粉颗粒上，再用海藻糖粒上，再用海藻糖包埋包埋，解决了酶泄漏的问题，解决了酶泄漏的问题， 利用两种或两种以上胶体耦合包埋技术能解决单一凝胶包埋机械利用两种或两种以上胶体耦合包埋技术能解决单一凝胶包埋机械强度不好或不易成型的问题，如，周爱梅等发现强度不好或不易成型的问题，如，周爱梅等发现明胶和卡拉胶具有协明胶和卡拉胶具有协同作用同作用，它们之间的耦合能够降低明胶的使用量，并提高机械强度。，它们之间的耦合能够降低明胶的使用量，并提高机械强度。Page 9（4）絮凝固定化与其他方法的耦合）絮凝固定化与其他方法的耦合 1977 年，年，Long Margarete 等提出絮凝固定化技术，用絮凝

13、剂等提出絮凝固定化技术，用絮凝剂对细胞进行处理，将得到的絮团经离心、过滤、压缩、干燥等工艺，对细胞进行处理，将得到的絮团经离心、过滤、压缩、干燥等工艺，得到粒径统一的固定化细胞颗粒。絮凝固定化具有条件温和，酶活回得到粒径统一的固定化细胞颗粒。絮凝固定化具有条件温和，酶活回收率高的优点，单一絮凝固定化的方法避免了将细胞从发酵液中分离收率高的优点，单一絮凝固定化的方法避免了将细胞从发酵液中分离的步骤，但操作过程也很复杂。如果絮凝的步骤，但操作过程也很复杂。如果絮凝- 吸附法将从发酵液（酶液）吸附法将从发酵液（酶液）絮凝出的酶直接吸附到介质上，可简化絮凝固定化的操作工序，并增絮凝出的酶直接吸附到介质

14、上，可简化絮凝固定化的操作工序，并增加固定化酶的稳定性。加固定化酶的稳定性。Nivedita kamat h 等利用多聚电介质的絮凝等利用多聚电介质的絮凝能力将尿素降解细胞吸附在棉布介质上降解尿素，大大降低了传统高能力将尿素降解细胞吸附在棉布介质上降解尿素，大大降低了传统高压分解釜分解尿素的费用，并适用于连续的操作。压分解釜分解尿素的费用，并适用于连续的操作。 絮凝絮凝- 包埋法的耦合能够较好地解决絮凝固定化方法，但包埋法的耦合能够较好地解决絮凝固定化方法，但机械强机械强度不好度不好，酶在包埋介质中容，酶在包埋介质中容易发生泄露易发生泄露。 絮凝絮凝- 交联、絮凝交联、絮凝- 微囊法能够有效地

15、微囊法能够有效地提高固定化载体的机械强度提高固定化载体的机械强度 Page 10（5）膜固定化与其他方法的耦合膜固定化与其他方法的耦合 膜固定化法又称酶截留法，是将膜固定化法又称酶截留法，是将酶限制在一定的范围内来实现酶限制在一定的范围内来实现固定化。固定化。膜固定化的方法可分为游离态和固定化态两种方式。固定化膜固定化的方法可分为游离态和固定化态两种方式。固定化式比较有利于反应器的控制，产品的分离纯化，反应器型式的选择。式比较有利于反应器的控制，产品的分离纯化，反应器型式的选择。能与膜耦合的传统固定化技术有吸附法、共价偶联法、絮凝法等，能与膜耦合的传统固定化技术有吸附法、共价偶联法、絮凝法等，

16、 Godevargova T 等分别用等分别用几种物质修饰膜几种物质修饰膜，并共价结合尿素酶，并共价结合尿素酶，发现经硫酸羟氨和硫酸肼修饰的膜固定化酶活力较高，发现经硫酸羟氨和硫酸肼修饰的膜固定化酶活力较高，70 C下，可能下，可能是用这两种方法修饰，酶分子和带电膜之间的间隔较大，酶不易受到是用这两种方法修饰，酶分子和带电膜之间的间隔较大，酶不易受到带电离子的影响，反应带电离子的影响，反应4 h后，游离酶完全失活，而固定化酶仍保持后，游离酶完全失活，而固定化酶仍保持80 % 的活力。的活力。 Akgo si nan 等通过共价活泼的染料等通过共价活泼的染料MX-5BR，并注入金属镍离，并注入金

17、属镍离子子Ni（）的方法）的方法活化聚乙酰膜活化聚乙酰膜，用该膜吸附固定化酶，可以通过吸，用该膜吸附固定化酶，可以通过吸附附- 解吸附重复利用酶，而基本没有酶活力损失。解吸附重复利用酶，而基本没有酶活力损失。Page 11n 多酶耦合多酶耦合 指将两种或两种以上的酶进行耦合以提高催化效率的方法，也可指将两种或两种以上的酶进行耦合以提高催化效率的方法，也可将两种不同的酶通过耦合固定化技术进行耦合，即双耦合（一指将两种不同的酶通过耦合固定化技术进行耦合，即双耦合（一指不同不同酶酶的耦合，二指的耦合，二指固定化技术固定化技术的耦合）的耦合） 刘洪等以玉米淀粉为反应底物刘洪等以玉米淀粉为反应底物,研究

18、了在微波辐射条件下诱导研究了在微波辐射条件下诱导淀粉酶和糖化酶耦淀粉酶和糖化酶耦合催化淀粉水解的特性，（此前相关研究未见报道）合催化淀粉水解的特性，（此前相关研究未见报道） 考察考察pH 值、温度、底物浓度、时间和微波功率对淀粉水解率的影响。值、温度、底物浓度、时间和微波功率对淀粉水解率的影响。结果表明结果表明, 微波微波双酶耦合催化淀粉的水解率比水浴加热提高双酶耦合催化淀粉的水解率比水浴加热提高20%以以上。（上。（2009） 彭益强等利用工程菌产的彭益强等利用工程菌产的1,3-丙二醇氧化还原酶丙二醇氧化还原酶进行转化进行转化3-羟基丙羟基丙醛为醛为1,3-丙二醇的反应，丙二醇的反应，同时偶

19、联甘油脱氢酶同时偶联甘油脱氢酶（由另一工程菌制备）（由另一工程菌制备）转化甘油的反应进行辅酶转化甘油的反应进行辅酶NADH的再生，实现了的再生，实现了1,3-丙二醇的双酶耦丙二醇的双酶耦合的连续反应。由于合的连续反应。由于来源于工程菌的双酶酶学性质相适应来源于工程菌的双酶酶学性质相适应，反应连续，反应连续进行进行34 h 后，底物后，底物3-羟基丙醛的转化率达羟基丙醛的转化率达63.4%，产物，产物1,3-丙二醇的丙二醇的产率达产率达64.6%。（。（2010）Page 12n 酶与其他技术的耦合酶与其他技术的耦合 包括酶和另一种非酶物质的耦合、酶和化学的耦合、酶和发酵的包括酶和另一种非酶物质

20、的耦合、酶和化学的耦合、酶和发酵的耦合等。耦合等。 程咏梅等发现了一种催化效率较高的消旋催化剂程咏梅等发现了一种催化效率较高的消旋催化剂CD550 树树脂脂, 其与脂肪酶耦合可成功催化其与脂肪酶耦合可成功催化1-苯乙醇的动态动力学拆分苯乙醇的动态动力学拆分(DKR).该该树脂树脂60 下可将下可将100 mmol/L (S)-1-苯乙醇于苯乙醇于1.5 h 内完全消旋内完全消旋. 当其当其应用于应用于1-苯乙醇的苯乙醇的DKR 反应时反应时, 通过采用结构较复杂的邻苯二酚二乙通过采用结构较复杂的邻苯二酚二乙酸酯、间苯二酚二乙酸酯、酸酯、间苯二酚二乙酸酯、3,5-二甲基苯酸乙酸酯作为酰基供体二甲

21、基苯酸乙酸酯作为酰基供体, 可可有效抑制树脂催化的底物无选择性转酯化有效抑制树脂催化的底物无选择性转酯化, 极大提高底物转化率和产极大提高底物转化率和产物物ee 值值.（2010） 徐晓滢等在徐晓滢等在实现高效实现高效D-海因酶固定化的基础上海因酶固定化的基础上，提出了利用，提出了利用耦耦合原位分离技术合原位分离技术制备制备N-氨甲酰氨甲酰-D-苯丙氨酸的方法，并通过对反应条苯丙氨酸的方法，并通过对反应条件的摸索，证实了该方法能有效提高混旋底物的生物转化，在底物溶件的摸索，证实了该方法能有效提高混旋底物的生物转化，在底物溶液浓度为液浓度为1 gL1 时，时，24 h 转化率可达转化率可达62.

22、 725%，较采用单一固定床，较采用单一固定床酶转化体系的转化率提高了酶转化体系的转化率提高了89. 3%。（。（2007，该反应分离耦合方面，该反应分离耦合方面的研究在国内外还是空白）的研究在国内外还是空白） Page 13四、酶耦合的应用进展四、酶耦合的应用进展n 酶与发酵耦合研究进展酶与发酵耦合研究进展 刘海清等利用刘海清等利用糖化发酵耦合工艺生产柠檬酸糖化发酵耦合工艺生产柠檬酸技术，研究了在发技术，研究了在发酵培养基中添加糖化酶对提高发酵液的糖化程度酵培养基中添加糖化酶对提高发酵液的糖化程度,增加发酵单罐产酸增加发酵单罐产酸,降低发酵残总糖和发酵粮耗的作用、同时研究在培养基中添加糖化酶

23、降低发酵残总糖和发酵粮耗的作用、同时研究在培养基中添加糖化酶的最佳温度、最佳数量、研究在发酵培养基中添加糖化酶生产工艺对的最佳温度、最佳数量、研究在发酵培养基中添加糖化酶生产工艺对提高产品质量的作用。解决了目前企业发酵生产柠檬酸过程中发酵转提高产品质量的作用。解决了目前企业发酵生产柠檬酸过程中发酵转化率低化率低,发酵粮耗高等问题。（发酵粮耗高等问题。（2011，专利），专利）n 多酶耦合新进展多酶耦合新进展 江波等发明了以蔗糖为底液江波等发明了以蔗糖为底液,采用采用蔗糖果糖转移酶和菊糖果糖转蔗糖果糖转移酶和菊糖果糖转移酶移酶,通过通过双酶耦合双酶耦合催化反应来合成双果糖酐催化反应来合成双果糖酐

24、III，该发明生产方法简单，该发明生产方法简单,对环境无污染对环境无污染,所得到的双果糖酐所得到的双果糖酐III安全可靠安全可靠,属于一种市场前景广阔属于一种市场前景广阔的低热量新型甜味剂的低热量新型甜味剂 （2011，专利，专利 ，江南大学），江南大学）Page 14n 酶固定化技术耦合的新进展酶固定化技术耦合的新进展 田景振等发明了一种以甜菊叶为原料田景振等发明了一种以甜菊叶为原料,利用利用酶法酶法进行低温浸提进行低温浸提,提取液经絮凝工艺除去胶体、色素等杂质后提取液经絮凝工艺除去胶体、色素等杂质后,再经一定截留分子量的再经一定截留分子量的超滤膜超滤膜进行膜过滤处理进行膜过滤处理,超滤液利

25、用树脂联用技术进行吸附、解吸、超滤液利用树脂联用技术进行吸附、解吸、脱色工序脱色工序,最后经喷雾干燥制得成品。本发明得到的产品最后经喷雾干燥制得成品。本发明得到的产品,经高效液相经高效液相色谱法分析色谱法分析,总苷含量在总苷含量在98以上以上,优于国际优级品，并能够有效的解优于国际优级品，并能够有效的解决常规方法生产周期长决常规方法生产周期长,甜菊苷转移率低等问题甜菊苷转移率低等问题,并能使树脂使用寿命并能使树脂使用寿命延长延长6倍以上。（倍以上。（2011，专利），专利）n 酶耦合法去消旋化的研究新进展酶耦合法去消旋化的研究新进展 李云龙从土壤中分离得到两株氧化还原酶菌株李云龙从土壤中分离得到两株氧化还原酶菌株:氧