金钗石斛遗传多样性研究的随机扩增多态DNA-PCR反应体系的建立与优化

1、金钗石斛遗传多样性研究的随机扩增多态DNA-PCR反应体系的建立与优化         09-09-03 10:12:00     编辑：studa20                       作者：王燕燕 徐红 魏丹红 王峥涛【摘要】  目的对

2、影响金钗石斛随机扩增多态DNA（RAPD）-PCR扩增效果的一些因素进行优化，为进一步研究其遗传多样性奠定基础。方法对金钗石斛RAPD分析中一些重要影响因素进行比较系统的构建和优化，建立金钗石斛RAPD稳定可靠的反应体系。结果金钗石斛较适宜的RAPD-PCR反应条件为：10l PCR反应体系中，520 ng 模板DNA，3.0 mmol·L-1Mg2+，0.34 mmol·L-1dNTPs，0.6 U Taq DNA聚合酶，1.5 mol·L-1引物，较适宜的退火温度为36 。结论所建立的金钗石斛RAPD反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、检测多态性能力较强等

3、特点，可用于金钗石斛的遗传多样性研究。以该优化的RAPD条件进行重复性实验，其实验结果重复性良好。 【关键词】  金钗石斛； 随机扩增多态DNA反应体系； 优化Abstract：ObjectiveTo establish and optimize RAPDPCR system of D. nobile Lindl.MethodsThe reliable RAPD-PCR system for the genetic diversity study of D. nobile Lindl. established by systematically testing and optimiz

4、ing the important concentrations of the factors. ResultsThe conditions that were suitable for RAPD-PCR of D. nobile Lindl. were as follows: 10 l PCR reaction system contained 520 ng template DNA, 3.0 mmol·L-1Mg2+, 0.34 mmol·L-1 dNTPs, 0.6 U Taq DNA polymerase and 1.5mol·L-1prime. The

5、suitable annealing temperature in the RAPD-PCR reaction system was 36 . ConclusionThe RAPD-PCR system, which was established in this paper for studying D. nobile Lindl., can provide clear, reliable, abundant polymorphic molecular markers,stable reaction system, and is suitable for studying the genet

6、ic diversity of D. nobile Lindl. The experiment results are reproducible based on this conditions.Key words：D. nobile Lindl.;  RAPD reaction system;  Optimization    金钗石斛Dendrobium nobile Lindl.又称金钗石、扁金钗、扁黄草、扁草、黄草，为兰科(Orchidaceae)石斛属Dendrobium Sw.植物，具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳的功效，是中药石斛

7、的主要来源之一。本草纲目中记载：金钗石斛可“强阴益精，厚肠胃，壮筋骨，暖水脏，补肾益力，轻身延年”等，是药用范围较广的名贵中药；又由于其花型奇特、花色艳丽，而具有较高的观赏价值1。近年来，我国学者对金钗石斛的生物学特性、药用价值、人工栽培、化学成分、药理、毒理等方面进行了较为广泛的研究13，而有关遗传多样性方面研究甚少。     随机扩增多态DNA（Random  Amplified  Polymorphic DNA,RAPD)技术是由Williams等于1990年创立的一种DNA分子标记方法，它可直接反映染色体组DNA多态性，能从遗传本质上揭

8、示品种间多态性及亲缘关系，不受环境限制，具有操作简单快捷、成本低、通用性好、灵敏度高且不需预先了解基因组的相关分子生物学信息等优点4,5，被广泛应用于种质资源分析、生物种群划分、遗传相关分析、遗传图谱构建、基因定位等方面6。    本实验就模板浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度、Taq酶浓度、引物浓度、退火温度等影响RAPD反应的诸因素进行了构建和优化，建立多态性强、稳定性好的金钗石斛RAPD反应体系，为进一步研究金钗石斛的遗传多样性、开发利用这一珍稀药用资源提供技术支持。1  材料与仪器1.1  材料  金钗石斛，新鲜材料于2005年

9、采自云南文山县，现保存于上海中医药大学中药研究所，材料经上海中医药大学中药研究所徐红博士鉴定原植物学名。1.2  仪器  PTC-200型PCR仪（MJ Research公司）；凝胶成像系统（美国Pharmacia Biotech）；电泳仪（Bio-Rad）；核酸蛋白分析仪（美国Beckman）；离心仪（美国Beckman）。1.3  试剂  CTAB、-巯基乙醇、Tris Balanced Phonel、Tris、EDTA、琼脂糖均为分析纯；10×PCR buffer,Taq DNA polymerase (Taq酶),MgCl2,dNTPs

10、 试剂购于上海生工公司；RAPD引物采用的为适于进行金钗石斛RAPD扩增的随机引物，由上海生工公司提供。2  方法2.1  总DNA的提取 采用改良的CTAB法。取新鲜叶片约1.2 g，用双蒸水洗净，加液氮手工研磨成细粉，迅速转移至4个10 ml离心管中，加入已65 预热的2 % CTAB提取液5 ml，混匀，65 保温24 h，期间多次轻轻颠倒混匀，使DNA提取充分；待提取液冷却至室温，加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇(25241)抽提10 min，12 000 r·min-1，离心10 min，吸取上清液，再用1/3体积的苯酚-氯仿-异戊醇(25241)抽提10

11、 min，12 000 r·min-1，离心10 min，吸取上清液，加入等体积氯仿-异戊醇(241)萃取液，上下多次颠倒，萃取充分直至两相间无白色中间层，12 000 r·min-1，离心10 min，吸取上清液，加1/2体积的异丙醇，1/10体积的3 mol·L-1 NaAc，混匀，-20 放置0.51 h，12 000 r·min-1，4 ，离心10 min，弃液，70 %乙醇洗涤沉淀物2次(4 ，12 000 r·min-1，离心5 min)，挥干至无醇味。其中一管加入适量TE液溶解，4保存备用，其余沉淀-20 保存备用。2.2

12、0; RAPD-PCR初始扩增体系  参考有关石斛RAPD分析的研究论文，确立本研究初始的反应体系条件，反应在10 l的体系中进行，其中包括10×PCR buffer 1 l，MgCl2 (25 mmol·L-1)0.8 l，dNTP mix (10 mmol·L-1)0.3 l，引物1.5 l（10 mol·L-1），Taq DNA polymerase (5 U·l-1) 0.12 l，模板溶液0.51 l（510 ng），ddH2O补足10 l。PCR扩增程序：94 预变性5 min，94 变性45 s，36 复性45 s，72

13、 延伸2 min，循环37次，然后72保温5 min，使DNA片段完全延伸。反应结束后，产物置4 冰箱保存。2.3  RAPD扩增中各影响因素2.4  PCR产物的鉴定  金钗石斛基因组DNA的RAPD扩增产物，以标准DNA GeneRulerTM DNA Ladder Mix和1 kb DNA Ladder为分子量标记，于1.5 %的琼脂糖凝胶（加入EB 0.4 g·ml-1）、5 V/cm电压下电泳分离扩增产物，电泳缓冲液为0.5×TBE，电泳80 min后在凝胶成像系统下成像。2.5  RAPD优化体系的验证采用不同的引物应用优

14、化好的RAPD体系对具有代表性的样本个体进行RAPD扩增。3  结果3.1  模板DNA的检测DNA经0.8的琼脂糖凝胶电泳(05×TBE，0.4 g·ml-1 EB)，电压125 V，电泳120 min，通过Image Master VDS凝胶成像系统观察，显示结果(图1)表明，抽提出的DNA以大片段形式存在（>10 000 bp），表明此种方式的DNA提取方法可行，所提取出的DNA可用于金钗石斛的RAPD分析。图1  总基因组DNA检测（略）图2  不同模板DNA浓度RAPD扩增效果（略）3.3  Taq酶单位Taq酶浓度在0.25 U，0.5 U时扩增条带数少，0