高效液相色谱_电喷雾质谱法测定血浆中曲美他嗪浓度

1、高效液相色谱/电喷雾质谱法测定血浆中曲美他嗪浓度焦阳1苏明明1陈闽军31贾伟1陶萍2仇益群3黄仲义31(上海交通大学药学院,上海2002402(上海交通大学分析测试中心,上海2000303(上海市静安区中心医院,上海200040摘要建立了高效液相色谱/电喷雾质谱法(HP LC /ESI 2MS 测定人血浆中曲美他嗪浓度。以利多卡因为内标,样品经甲醇沉淀蛋白,取上清液用三氟乙酸酸化后,50真空离心,浓缩至干,流动相溶解后进样。色谱柱:W aters Xterra M S C 18(150mm ×4.6mm,5m ,柱温:40,流动相:pH 2.00的三氟乙酸溶液2甲醇(6040,V /

2、V ,流速:0.6mL /m in;电喷雾离子源,四级杆质谱检测器,选择离子监控模式,检测离子的质核比分别是235(利多卡因和267(曲美他嗪。曲美他嗪的线性范围为2.5100g/L,检出限2.5g/L;日间、日内相对标准差均小于7%;相对回收率96.45%103.03%,提取回收率72.45%80147%。关键词曲美他嗪,高效液相色谱2电喷雾质谱,血浆,药代动力学2006206228收稿;2006211214接受3E 2mail:cm jsjtu .edu .cn1引言曲美他嗪(万爽力,Tri m etazidine 是临床治疗心肌能量代谢紊乱的有效药物之一1,它能够选择性抑制线粒体氧化32

3、酮酰辅酶A 硫解酶的活性,将氧化代谢底物由脂肪酸转向葡萄糖,从而显著提高心脏三磷酸腺苷水平,起到保护缺血心肌细胞作用2。血浆中曲美他嗪浓度的测定方法有高效液相色谱法(HP LC 3、高效液相色谱荧光检测法(HP LC /F D 4、气相色谱质谱联用法(GC /MS 5和高效液相色谱/串联质谱联用法(HP LC /MS/MS 6,7。HP LC 的检测灵敏度很难满足临床药代动力学的要求;HP LC /F D 和GC /MS 法都需要衍生化,导致样品前处理繁琐,不利于大样本量检测。本研究建立的HP LC /ESI 2MS 法测定血浆中曲美他嗪浓度,样品前处理简捷,测定快速、准确,可满足临床人体药代

4、动力学及血样浓度检测的要求。2实验部分2.1仪器与试剂1100系列LC 2MS,包括G1312A 型二元高压泵、G1322型在线脱气仪、G1313A 型自动进样器、G1316A 型柱温箱、G1315A 型二极管阵列检测器、1946A 型四级杆电喷雾质谱检测器和LC /MS D Che m 2Stati on 工作站(美国安捷伦公司;W aters Xterra MS C 18(150mm ×4.6mm ,5m 色谱柱(S N:024*,W aters 。LNG 2T88真空离心浓缩仪(江苏太仓华美生化仪器厂。2.2储备液的制备称取两份20.00mg 曲美他嗪对照品,分别置于50mL

5、容量瓶中,流动相溶液溶解并定容至刻度,得0.4g/L 曲美他嗪储备液和质控储备液。称取25.00mg 利多卡因标准品,加流动相溶液溶解并定容至25mL,得1.0g/L 利多卡因储备溶液。以上3种溶液均置于4冰箱避光保存。用流动相分别稀释曲美他嗪储备液至1000、800、400、200、100、50和25g/L,作曲美他嗪工作液;另用流动相分别稀释质控储备液至800、200和50g/L,作质控溶液;用流动相稀释利多卡因储备溶液至1000g/L,作内标工作液。第35卷2007年4月分析化学(FE NX I HUAXUE 研究简报Chinese Journal of Analytical Che m

6、 istry 第4期5415442.3HP LC/ES I2M S分析条件流动相为甲醇2pH2.00的三氟乙酸溶液(4060,V/V,流速0.6mL/m in,柱温40,进样量90L。电喷雾离子源,雾化气(N2压力208kPa,干燥气(N2的流速和温度分别设为9.0L/m in和350,毛细管电压4.0k V;选择离子监测模式,检测离子质荷比为235(利多卡因和267(曲美他嗪,裂解电压70V。2.4生物样品前处理精确吸取500L血样置于5mL具塞玻璃离心管中,精确加入50L内标工作液,混匀;再加入1mL甲醇,涡旋振荡30s,以3000r/m in离心8m in;小心吸取上清液至2mL离心管中

7、,加入30L三氟乙酸溶液(15,V/V,混匀后置真空离心浓缩仪中,50挥干,用200L流动相溶解,以14000r/m in 离心5m in,取上清液90L进样。3结果与讨论3.1样品的HPLC/ES I2M S分析条件的优化利多卡因在样本处理过程中性质稳定,重现性好,保留时间及峰形良好,与曲美他嗪无干扰,实验中选作内标化合物。曲美他嗪为弱碱性化合物,pH值对其分析过程有很大影响,经反复实验后采用pH 2.00的三氟乙酸水溶液与甲醇共同作为流动相,显著增加了目标检测物的离子化效率,并有效地改善峰形。为能够使电喷雾质谱仪得到稳定的喷雾,仪器的雾化气(N2压力设为0.207MPa;毛细管电压优化为4

8、.0kV,确保得到响应值高且稳定的信号。图1显示的是曲美他嗪分子和利多卡因分子在裂解电压优化为70V时,全扫描模式(扫描质核比范围为50350m/z下得到的电子轰击质谱图。其中曲美他嗪的碎片离子峰267(m/z的响应值最大,利多卡因的碎片离子峰235(m/z的响应值最大。因此,实验选定267和235作为监测离子进行专属性扫描,可避免干扰且提高目标检测物的灵敏度。图1曲美他嗪(a和利多卡因(b的质谱Fig.1M ass s pectra of tri m etazidine(aand lidocaine(b裂解电压(the frag ment voltage:70V,扫描质量范围(the mas

9、s range50350m/z。3.2样品前处理方法的优化本研究曾对液液萃取法和直接沉蛋白法进行比较。在考察液液萃取法时,选用乙醚、正己烷、环己烷和乙酸乙酯4种提取溶剂,对含曲美他嗪血样进行萃取分离。由于曲美他嗪是弱碱性分子,当体系的pH为碱性时,曲美他嗪以分子形式存在,有利于提取回收。然而,有文献报道在较高的pH条件下,曲美他嗪的血浆蛋白结合率也较高8。研究中发现,在所考察的4种提取溶剂中,即使是萃取效果最好的乙酸乙酯,提取回收率也只有50%左右。在考察直接沉淀蛋白法时,比较了甲醇和三氟乙酸两种蛋白沉淀剂。其中,三氟乙酸作为蛋白沉淀剂用量较少,但需要使用其它的碱作为中和剂,且残留于体系的中和

10、剂常常会抑制质谱离子化效率,降低检测灵敏度;甲醇作为蛋白沉淀剂,可以有效沉淀绝大部分蛋白,同时辅以少量三氟乙酸调节pH值,可降低曲美他嗪与血浆蛋白的结合率,同时又不需使用碱来中和,结果使得提取回收率达到70%以上。经比较后,选定甲醇辅以三氟乙酸沉淀蛋白作为样品前处理方法。进一步优化了甲醇、三氟乙酸溶液的配比,在甲醇与血浆比例为1.51、21、2.51和31的条件下,分别加入20、30、40和50L三氟乙酸溶液(15,V/V的蛋白沉淀。结果表明:在甲醇与血浆比例为21的体系中,加入30L三氟乙酸溶液(15,V/V时提取回收率最高。245分析化学第35卷本实验的样品前处理方法能够快速、有效地消除血

11、浆中蛋白对系统的影响,减少因质谱离子源和毛细管受到污染造成响应值大幅度降低的弊端,使色谱柱在分析过程中柱效稳定,延长色谱柱使用寿命。3.3方法专属性考察分别取空白血浆、均匀混合的400g/L 曲美他嗪溶液和1000g/L 内标利多卡因溶液的血浆以及加入1000g/L 内标利多卡因的健康受试者给药8h 时收集的血浆样品,依2.4方法操作,得图2。曲美他嗪的保留时间约为3.47m in,利多卡因的保留时间约为5.05m in 。结果表明,空白血浆中内源性物图2不同血浆样品的选择离子监控模式的色谱图Fig .2Chr omat ogra m s of tri m etazidine and rido

12、caine in p las ma at selected i on monit oring (SI M mode 1.空白血浆(blank p las ma ; 2.空白血浆+曲美他嗪(40g/L +利多卡因(100g/L (a s p iked p las ma sa mp lewith tri m etazidine (40g/L and lidocaine (100g/L ; 3.受试者服药8h 后血浆(tested p las ma sa mp le;tri m etazidine at3.47m in,lidocaine at 5.05m in 。质不干扰目标物的测定。3.4线性范

13、围和定量检出限精确吸取500L 健康人空白血浆7份,分别加入50L 不同浓度的曲美他嗪工作液,配制成曲美他嗪浓度分别为2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0和100.0g/L 血浆样品,依2.4方法操作。以曲美他嗪和内标的峰面积比(Y 对曲美他嗪的浓度(X 进Table 1Recovery and p recisi on of tri m etazidine in p las ma (n =5标示浓度Sp iked concentrati on (g/L 提取回收率(平均值±标准差Extracti on recovery (Mean ±S D (%相对回收率

14、(平均值±标准差Relative recovery (Mean ±S D (%相对标准差RS D (%日间I ntra 2day 日内I nter 2day 5.0图319名志愿者口服20mg 曲美他嗪后的平均血药浓度2时间曲线Fig .3Hu man p las ma concentrati on 2ti m e p r ofileafter oral ad m inistrati on of tri m etazidine (20mg 3.6精密度和相对回收率次,在连续3d 内重复测定3次,且均与标准曲线同时进行,根据此时的标准曲线计算曲美他嗪实测浓度,并与标示浓度相比

15、,采用单因素方差分析计算方法学精密度,用RS D表示,相对回收率用实测浓度平均值与标示浓度的比值百分数(%表示,结果表明(如表1:日间、日内精密度及相对回收率均满足生物样品分析的要求。3.7方法应用19名健康男性志愿者分别口服盐酸曲美他嗪片剂20mg,平均血药浓度2时间曲线见图3。志愿者分别在服药前、服药0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12和24h 取前臂静脉345第4期焦阳等:高效液相色谱/电喷雾质谱法测定血浆中曲美他嗪浓度445分析化学第35卷血4mL,置肝素抗凝管内、离心(4000r/m in,10m in分离出血浆,置-20冷冻保存备用。依214方法处理血浆样品,每个志

16、愿者的全部血浆样品在同一批测定,且每批生物样品测定时建立新的标准曲线。同时,在各分析批次样品中均匀随机放置高、中、低3个浓度的质控样品,以此来监控分析过程的有效性。References2Kant or P F,Lucien A,K ozak R,Lopaschuk G D.C irc.Res.,2000,86(5:5805887Medvedovici A,A lbu F,Georgita C,David V.B io m ed.Chro m atogr.,2005,19(7:549555D eter m i n a ti on of Tr i m et az i d i n e i n Hu

17、man Pl a s ma by H i ghPerfor mance L i qu i d Chro ma tography2M a ss Spectro m etryJ iao Yang1,Su M ing2M ing1,Chen M in2Jun31,J ia W ei1,Tao Ping2,Q iu Yi2Qun3,Huang Zhong2Yi31(School of Phar m acy,Shanghai J iaotong U niversity,Shanghai2000302(Instrum ental A nalysis Center of Shanghai J iaotong

18、 U niversity,Shanghai2000303(Shanghai J ingan Hospital,Shanghai200040AbstractA sensitive and s pecific high perf or mance liquid chr o mat ography/electr os p ray i onizati on2mass s pec2 tr o metry(HP LC/ESI2MSmethod has been devel oped and validated f or the identificati on and quantificati on of

19、tri m etazidine(T MZin hu man p las ma.The T MZ and internal standard,lidocaine,were is olated fr o m p las ma by p r otein p reci p itati on with methanol.The acidified supernatant was dried in a r otati onal2vacuu m2concentrat or, and the residue was diss olved with mobile phase p ri or t o analys

20、is.Chr o mat ographic separati on was perf or med on a Xterra MS C18colu mn(150mm×4.6mm,with5m particle sizewith the mobile phase consisting of metha2 nol and water(pH=2.0adjusted with trifluor oacetic acid(4060,V/V,and the fl ow rate was0.6mL/m in. Detecti on was perf or med on a single quadrupole mass s pectr omet