电解性自由基对离体豚鼠冠脉内皮与气道上皮的损伤作用

1、    电解性自由基对离体豚鼠冠脉内皮与气道上皮的损伤作用            关键词：电解；自由基；豚鼠；冠状血管；气管；上皮    中国病理生理杂志000921    摘 要 目的和方法：采用电解Krebs灌流液产生自由基的方法，观察电解性自由基对豚鼠离体心脏冠脉内皮与气道上皮功能的影响。结果：10 mA直流电，持续1-2 min电解灌流液产生的自由基

2、导致离体心脏冠脉压升高约4.4 kPa,同时使心肌收缩力下降,心肌组织过氧化脂质含量增高,而SOD活性降低;使离体支气管肺灌流压升高约2.20 kPa ，并对磷酸组胺反应性增高3倍； 电解灌流液的作用可被羟自由基清除剂甘露醇、DMSO抑制。结论：电解性自由基可引起冠脉内皮与气道上皮损伤,使冠脉和气道反应性增高。    中分类号 R543.3+3； R562.1+1 文献标识码 A    文章编号 1000-4718(2000)09-0848-04    Effects of

3、electrolyzed free radicals on endothelium of isolated    guinea pig coronary and epithelium of airway tube    CHEN Lin-xi, CHEN Jian-xiong， LIAO Duan-fang, ZHU Bin-yang， YI Lin    (Department of Cardiopulmanary Pharmacology,Hengyang Medical

4、 College,Hengyang 421001,China)    Abstract AIM and METHODS:To study the damage effects of free radicals from electrolyzed krebs solution(direct current,10 mA,1-2 min) on isolated guinea pig coronary and airway tube. RESULTS:In Langendorff's perfused guinea pig hearts,the ele

5、ctrolyzed free radicals increased coronary perfusion pressure(4.4±1.2) kPa,inhibited myocyte contractility (0.8±0.8) g vs (2.9±0.6) g，P<0.05,increased TBARS level and decreased SOD activity.In isolated perfused lungs of guinia pig,electrolyzed Krebs solution promoted significantly

6、the airway perfusion pressure (0.03±0.01) kPa vs (2.20±0.29) kPa,P<0.01 and histamine reactivity (0.65±0.37) kPa vs (2.05±0.25) kPa, P<0.01. Hydroxyl radicals scavenger DMSO and natural medicine gypenosides prevented the effects of oxygen free radicals. CONCLUSION: These re

7、sults indicated that the free radicals by electrolyzation could induce damages of coronary endothelium and airway epithelium.    MeSH Electrolysis; Free radicals; Guinea pigs; Coronary vessels; Trachea; Epithelium    氧自由基是一组非常活跃的极性基团，可引起细胞膜脂质过氧化损伤、灭活一氧化氮、氧化低密度

8、脂蛋白、诱导血小板聚集、刺激某些原癌基因表达等，在心、肝、肺、肾、脑等器官疾病发生发展过程中起重要作用。细胞、组织、器官自由基损伤模型制备常采用内源性或外源性两种自由基产生方式。前者常用缺血/再灌注,后者常用黄嘌呤+黄嘌呤氧化酶。由于黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶价格昂贵，如采用较长时间灌流，则需消耗大量试剂，加之黄嘌呤氧化酶较易失活，产生氧自由基的时间和强度难以控制，应用受到一些限制。我室建立了电解性产生氧自由基的方法并观察了电解性自由基损伤主动脉、脑血管内皮的作用，效果良好1-5。本实验旨在观察电解性自由基损伤离体豚鼠心脏冠状动脉内皮和气道上皮的作用。    

9、材 料 和 方 法    一、药品    硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)瑞士Fluka产品;绞股蓝总皂甙(gypenosides,GPS,湖南医科大学药理室赠送)；邻苯三酚(遵义化工厂)，二甲基亚砜(DMSO，天津化学试剂厂),甘露醇注射液(mannitol,江苏常熟制药厂)，磷酸组胺(histamine,HA，上海生化研究所),均为分析纯。    二、方法    (一)电解性自由基产生方法 采用本室建立

10、的方法，以YSD-5型药理生理多用仪输出1、2、5 mA恒定直流电电解灌流Krebs液(mmol/L:NaCl 115.0, KCl 4.6, MgSO4 1.16, NaH2PO4 1.16, NaHCO3 21.9, CaCl2 2.5, Glucose 11.0, 流速5 mL/min)持续8 min,每隔30 s取1 mL Krebs液以细胞色素c还原法在550 nm波长下测定自由基含量。    (二) 化学性自由基产生方法 以10、30、100 mol/L黄嘌呤加5 u/L黄嘌呤氧化酶共同孵育，每30 s取样测定超氧化物5。 

11、0;  (三) 豚鼠Langendorff心脏电解性自由基损伤冠状动脉内皮模型 参照本室方法，先备好Langendorff心脏，然后将两铂金丝电极置于主动脉插管内，阳极距主动脉5 cm,阴极距主动脉10 cm,用YSD-5型药理生理多用仪输出10 mA恒定直流电电解灌流Krebs液，持续时间1 min,记录如下指标：以对照组冠脉压为零，记录处理后冠脉压净增值，并记录心肌收缩力(ventricular contractile force，VCR),处理后取心肌组织匀浆，按硫代巴比妥酸法7测定心肌组织过氧化脂质(LPO)，结果以硫代巴比妥酸反应产物(thiobarbituric

12、 acid reactive substance,TBARS)含量表示。按邻苯三酚法8测定心肌组织SOD活性。实验分为空白对照组，电解损伤组和电解损伤+绞股蓝总皂甙组。    (四)豚鼠离体支气管肺灌流9电解系统损伤气道上皮模型 取300 g左右豚鼠，雌雄均可，先击晕后放血处死，快速分离支气管肺，在肺动脉处切1小口，用充氧Krebs液冲洗干净后将支气管固定于不锈钢管上，并在肺表面用针头刺数孔，37 恒温，以10 mL/min Krebs液流速灌流，参照本室5的方法，将铂丝电极置于管内，阳极距标本上端4 cm, 阴极距标本上端8 cm,通以10 mA恒定电

13、流，电解Krebs液,持续时间为2 min。以二道生理记录仪记录支气管肺灌注压(kPa)，并以组胺作用时灌注压的变化表示气道反应性。实验分为对照组、电解损伤组、电解损伤+二甲基亚砜组和电解损伤+甘露醇组。    结 果    一、不同电流时电解性自由基的产生     Fig 1 changes of electrolyzed free radicals in different electric current intensity.   

14、0;1 不同电流时电解性自由基的变化    如1示， 在1、2、5 mA电流下电解灌流液,自由基在1 min内达高峰,并呈稳定状态,停止电解后自由基产生迅速减少。    二、黄嘌呤+黄嘌呤氧化酶时超氧化产物的产生    Fig 2 Superoxide production curves of differente xanthine+xanthine oxidase.    2 不同黄嘌呤+黄嘌呤氧化酶时超氧化产物变化 

15、60;  如2示，黄嘌呤加黄嘌呤氧化酶法产生自由基迅速，达峰时间短，持续时间短，且呈剂量依赖性。    三、 电解性自由基对离体豚鼠冠脉灌注压及心肌收缩力的影响    表1显示，10 mA电流电解灌流液1 min，冠脉压明显升高，同时心肌收缩力明显下降。绞股蓝总皂甙升高心肌收缩力，降低冠脉压。    表1 电解性自由基对离体豚鼠冠脉灌注压    及心肌收缩力的影响    Tab

16、 1 Effect of electrolyzed free radicals on perfusion pressure of    isolated guinea pig coronary and ventricular contractile force(±s. n=10) Group    Coronary pressure net    increment(kPa)    Ventricular contractil

17、e    force(g)    Control    0    2.9±0.6    Electiolysis    4.4±1.2    0.8±0.8*    GPS    1.1±0.6* *

18、    1.8±0.6* *    *P<0.01 vs control; * * P<0.01 vs electrolysis.    四、电解性自由基对离体豚鼠心肌组织TABRS含量和SOD活性影响    如表2所见，电解性自由基损伤冠脉内皮后心肌组织TBARS升高，而SOD活性下降.绞股蓝总皂甙降低TABRS含量，升高SOD活性。表2 电解性自由基对离体豚鼠心肌组织   

19、0;TABRS含量和SOD活性影响    Tab 2 Effect of electrolyzed free radicals on TBARS contents    and SOD activity of isolated guinea pig heart tissue(±s) Group    n    TBARS(nmol/mg wet wt)    n  &

20、#160; SOD(u/mg wet wt)    Contro    l8    84.1±10.6    8    1.06±0.40    Electrolysis    5    114.2±24.7*  

21、60; 7    0.44±0.13* *    GPS    10    61.4±17.9* * *    10    0.95±0.21* * *    *P<0.05, * * P<0.01 vs control; * * * P<0.01 vs ele

22、ctrolysis.    五、 电解性自由基对离体豚鼠支气管肺气道上皮功能的影响表3 电解性自由基对离体豚鼠支气管    肺气道上皮功能的影响    Tab 3 Effect of electrolyzed &127;free&127;radicals on air tube perfusion    pressure and histamine reactivity of isolated guinea pig (&

23、#177;s) Group    n    bronchiallung perfusion pressure(kPa)    n    HA activity(kPa)    Control    10    0.03±0.01* *    5  &

24、#160; 0.65±0.37* *    electrolysis    10    2.20±0.29    5    2.05±0.25    DMSO    8    0.87±0.17* *  

25、60; MAN    6    0.97±0.24* *    * * P<0.01 vs electrolysis.    如表3所示，10 mA电流电解支气管肺灌流液2 min，发现支气管肺灌流压从(0.03±0.01) kPa上升至(2.20±0.29) kPa,对磷酸组胺反应性增加3倍.预先用DMSO 10 mmol/L及甘露醇50 mmol/L分别灌流15 min,则可对抗电解性氧

26、自由基的作用。讨 论    氧自由基因可损伤细胞生物膜,促进粘附分子表达, 修饰低密度脂蛋白,诱导血小板聚集,灭活一氧化氮及诱导原癌基因表达，在动脉粥样硬化、心肌缺血再灌注损伤、支气管哮喘、呼吸窘迫综合征等心肺疾病中起重要作用。    各种器官的氧自由基损伤模型已成为研究很多疾病防治的常规方法。在实验中产生外源性氧自由基的常见方法为黄嘌呤+黄嘌呤氧化酶法，该方法所产生的氧自由基时间短暂，采用较大剂量也只能维持20 min,而且到达高峰的时间相对电解法达高峰时间长,本实验也证实如此，加之,黄嘌呤氧化酶易失活，间隔一段

27、时间所产生的氧自由基量有较大差异,重复性相对较差。此外,试剂昂贵也是该方法在一般实验室使用受到限制的原因。本实验所用的电解灌流液产生氧自由基的方法简便实用,设备易得,成本低,操作简单,重复性好,产生时间可控,本室曾多次采用本法研究绞股蓝总皂甙对心脏、血管功能的影响3-5,结果比较稳定可靠。    本实验结果显示电解灌流液产生的氧自由基能明显升高冠脉灌注压，抑制离体豚鼠心肌收缩力，增加心肌组织TABRS含量，降低SOD活性。同时，电解灌流液产生的氧自由基能使支气管平滑肌收缩，离体豚鼠气道阻力增加，灌注压升高,且此作用可被羟自由基清除剂甘露醇、DMSO抑制，

28、此外,电解性氧自由基还能引起支气管对组织胺反应性明显升高，中药绞股蓝总皂甙及自由基清除剂甘露醇和DMSO均可拮抗或逆转电解性氧自由基的损伤作用。 电解性氧自由基可损伤血管内皮细胞，NO和PGI2释放减少，血管收缩2；氧自由基也可损伤气道上皮细胞，释放内皮素等，引起气道反应性增高10。    需要指出的是电解灌流液产生氧自由基是一种混合自由基，包括H2O2,OH*,O?2,ClO3-等。而黄嘌呤+黄嘌呤氧化酶所产生的氧自由基绝大部分是O?2。因此，若想研究某一特定种类自由基的作用，则不宜采用电解法。    基金项目

29、国家自然科学基金资助(No.39200151)    Tel:#160;   参 考 文 献    1 廖端芳,陈 修.一种观察血管内皮损伤与自由基关系的新方法J.中国药理学与毒理学杂志,1991,5:231-234.    2 廖端芳，余 麟,陈剑雄,等.一种观察血管内皮损伤与自由基关系的新方法. 内皮扫描电镜观察J. 衡阳医学院学报,1992,20(4):341-345.    3 肖观莲，廖端芳,余 麟,等.一种筛选抗自由基药物的简便方法J. 衡阳医学院学报，1993，22(2):224-225.