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文档简介
1、贴壁细胞药物摄取实验 贴壁细胞的药物摄取试验应用更为广泛,通过试验可以了解转运体对药物的摄取动力学特征,预测药物在体内的汲取、分布、排泄等过程。贴壁细胞来源广泛可以是培养的新奇组织细胞(如肝细胞)、肿瘤细胞(如应用广泛的caco-2细胞)、转染特定转运体的转染细胞等。近年来随着分子生物学的进展,特殊是转染细胞如oatl-, oat3-hek293细胞、oatpibi-, oatpib3-hek293细胞、oatp2bl-cho细胞、oatpl-xenopus oocyte细胞、pept1-hela细胞等,已经成为药物转运讨论和新药开发的重要工具。 【材料】 1贴壁细胞若干。 2取试剂、非必须、
2、培养基(dmem培养粉或rpmi 1640,m 199等),0.4锥虫蓝、待测药物溶液、24孔板、krebs-henseleit液(118mm nac1,23.8mm nahc03,4.8mm kcl,1.omm kh2p04,1.2mm mgs04,12.5mm hepes,5.0mm glucose,and 1.5mm cac12,调整ph 7.4) ,triton-x-100,bca试剂盒。 3仪器及试剂净化工作台、倒置显微镜、酶标仪、co2培养箱、高压灭菌仪、恒温水浴振荡培养箱、高速冷冻离心机、高效液相色谱-质谱联用仪。 【办法】 1细胞复苏与培养将装有细胞的冷冻管从液氮罐中取出,快速
3、放入37水浴中,迅速摇摆,直至冻存管中冻存液彻低溶化后取出,以上操作在1分钟之内完成。消毒瓶盖后打开,吸出细胞液置于含有培养液的具塞离心管中,混合后低速离心,除去上清液,重复洗两次。接种于培养瓶中,在37 5% co2相对湿度90的细胞培养箱中培养。 2接种培养待细胞密度达到培养瓶面积的70%80时用0.25%-0.02% edta混合消化液消化数分钟,再加入适量培养液,用吸管轻轻吹打细胞成单细胞悬液,调节细胞浓度接种于无菌24孔板中(1x105孔),继续培养35天,待密度达到孔面积70%80可举行药物摄取试验。 3用移液器将24孔板中培养液吸取整洁,用预孵至37的krebs-henselei
4、t液轻柔的清洗2遍,将细胞表面的培养液清洗整洁。 4用移液器将krebs-henseleit液(37)加入24孔板中(1毫升孔)置于恒温水浴振荡培养箱中平衡10分钟。 5用移液器将平衡液吸尽,加入1 ml含待测药物krebs-henseleit液(预孵至37)开头摄取试验。 6达到预设的时光点用移液器吸尽药液,同时加入1 ml冷的krebs-henseleit液(0)终止摄取反应。 7用移液器吸尽冷的krebs-henseleit液,用冷的krebs-henseleit液轻柔的清洗2遍以洗净细胞表面吸附的待测药物。 8用移液器加入0.3 ml/孔的0.1% triton x-100,37振荡裂
5、解1.5小时。 9取适量细胞裂解液按bca试剂盒操作解释测定蛋白浓度,剩余裂解液放于-20保存;测定时经沉淀蛋白等处理后用lc-ms定量测定。 【结果与分析】 确定药物的线性摄取时光,作药物摄取量随时光变幻曲线,从而确定线性摄取时光;按照确定的线性摄取时光,分离在37和4下举行药物浓度依靠性摄取试验,作药物摄取量随药物浓度变幻曲线;由eadie-hofstee方程以特异性摄取初速度()对初速度与药物浓度比值(/s)计算km, vmax,表征待测药物摄取的动力学特征。 【注重事项】 1有些细胞在低代时简单贴壁,生长良好,在传到几十代以后,易聚拢成团,且贴壁不牢,即使消化后也不简单吹打成单细胞悬液,因此最好在购入时先大量冻存。 2用于药物摄取试验的细胞应处于对数生长久,此期细胞数随时光变幻成倍增长,活力最佳,最适合举行试验讨论。 3有些细胞不简单贴壁或贴壁不牢,
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