ctDNA检测技术

1、ctDNA 检测技术循环肿瘤 DNA(circulating tumor DNA,ctDNA) 来源于肿瘤细胞的凋亡、坏死 或分泌产生的 DNA 片段，是循环游离 DNA(circulating cell-free DNA,cfDNA) 的一部分 1。 ctDNA 含有与其来源肿瘤 DNA 同样的基因缺陷，如点突变，重排，扩增等 2；其在血液中的半衰期短，可实时反映肿瘤的动态变化 3;作为液体活检的一种，可克服组织活检中由于肿瘤异质性带来的缺陷，检测更全面4,因此ctDNA 的检测可用于癌症早期诊断与癌症分期、 肿瘤的疗效评估、 复发监测和预 后判断等 5。由 ctDNA 的质量和数量变化大

2、, 因此需要高特异性和高灵敏度的检 测方法。目前常用的方法有数字 PCR (digital PCR, dPCR)、BEAMing (bead, emulsion,amplification and magnetic)高通量测序(next generation sequencing, NGS)ARMS 等6。1. 数字 PCR1999年Vogelstein等提出了数字PCR(digtal PCR,dPCR)的概念。数字PCR包括两部分，即 PCR 扩增和荧光信号分析。先将是样品稀释后分配到大量微小的 反应单元中，每个单元包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子 ,然后分别对目标分子进行扩增，扩增结束

3、后对每个反应单元的荧光信号进行采集。数字PCR采 用直接计数的方法进行定量分析 , 有荧光信号的反应单元中至少包含一个拷贝0，理论上，在样品中极限稀释的情DNA 分子的拷贝数。 但是有的反应的目标分子，记为 1，无荧光信号的则即为 况下，有荧光信号的反应单元数目等于目标这时需要用泊松概率分布公式进行单元中可能包含两个或两个以上的目标分子，计算。不同于传统的qPCR技术，数字PCR不受扩增曲线的循环阈值(Ct)和扩 增效率的影响，无需参照，准确性和重复性好，可实现绝对定量分析9。根据反应单元类型不同，数字PCR分为三类：微反应室/孔板数字PCR、微流 控芯片和微滴数字 PCR 系统。微反应室 /

4、孔板数字 PCR 借助高通量自动上样设 备和增加的反应单元数 ,实现快速精确取样， 提高检测灵敏度。 微流控芯片技术是 一种基于含有数千个超高密度亲疏水微孔芯片的 dPCR 平台，可实现高通量、 低 成本分析。微滴数字PCR ( drop let digital PCR ,dd PCR)是将含有目标分子的样品分成成千上万个纳升级的油包水微滴， 再对每个微滴进行扩增， 和荧光信号的采 集，更容易实现小体积和高通量 10。数字PCR可绝对定量，是目前灵敏度最高的检测技术，但其也存在一定缺点, 如生成的微滴必须服从泊松分布， 所以不适合高浓度 DNA 样本检测，；只能检测 已知的突变且一次只能检测一

5、种突变 11,12。2. BEAMing 技术BEAMing 技术在检测 ctDNA 内体肿瘤突变具有非常高的灵敏度， 它是结合了数字PCR以及流式技术的一种检测方法，最早是由Bert Wgelstein提出。其方法是每一类 DNA 分子都会专一的与磁性珠相连接，然后 DNA 分子之间的差异可以通过流式细胞仪检测荧光标记来做出评估。这种方法是基于小珠（Bead）、乳浊液（Emulsion）、扩增（Amplification）、磁性（Magnetic）,这四个主要组分来构建的, 所以被称作为 BEAMing 13。BEAMing 技术的过程包括： 首先是分离和纯化血浆中的 DNA ；接着是预扩增

6、 步骤，通过使用常规 PCR 扩增目的基因片段，使用引物与已知的标记序列混合； 然后，这些 DNA 模板再通过乳液 PCR 扩增，应用引物探测这些序列，通过链 酶亲和素磁珠相互作用与有磁性的微胶珠结合。 通过这种方式设计的系统， 在反 应结束之前，每个乳液液滴中生成的 PCR 产物将保持对微胶珠的附着性，使其 可以很容易地通过磁性进行分离和纯化 14。并且， BEAMing 技术是利用磁珠来 吸附游离 DNA ，它可以从 1 万个健康细胞 DNA 中检测出那一个 ctDNA 分子，ctDNA具有较高的敏感性，同时在很多研究中其在肿瘤组织中发现的突变都和部分突变是一致的 15,16。BEAMin

7、g 技术相比其他检测技术具有很多优势： （一）在常规实验室条件下， 数以万计的 DNA 分子可以通过该种方法来进行评估。 （二）特异的突变可以通过 流式细胞仪进行分离筛选以备进一步分析和研究。（三）BEAMing技术可以用来 对特定组织或者人群中罕见的突变， 以及研究一般基因序列或转录的产物的变异 都可以提供相应的鉴别和定量分析。由于外周血流中 ctDNA 拷贝的数量是很低 的，特别是相较于野生型 DNA 来说。出于这个原因，使用 PCR 进行 DNA 扩 增是 BEAMing 过程中的一个重要部分，是确保可靠检测的保证 5。然而， BEAMing 这项检测技术只能检测已知突变， 且成本较高

8、17 同时，它的 操作也较复杂，通量低，且单分子扩增在非均一的微滴中实现，需要 RCR 预扩增，会增加试验误差 12。3. 基于 NGS 技术的检测方法ctDNA 检测技术，除了基于 PCR 检测方法之外，还有一种以高通量测序技术，又称下一代”测序技术(NGS)为基础的检测方法。这种方法主要是选定十几到 几十个肿瘤相关基因进行测序，测序通量和效率高。根据富集策略的不同，基于NGS的技术目前又可分为靶向扩增子测序(TAS)及 目标序列捕获测序 (TCS)。靶向扩增子测序(TAS)技术是针对目的基因设计几十对甚至上百对PCR引物，利用多重 PCR 扩增富集。代表性方法有标记扩增深度测序 (TAM-

9、Sec)。 Forshew 等 18 通过 TAM-Sec 测序技术，检测患者癌细胞中 ctDNA 片段，从而找到肿瘤 样品中的遗传突变。这种方法无需外科手术或者活检，就可以找到癌症突变。目标序列捕获测序(TCS)技术是针对目的基因设计探针，通过捕获杂交的方法 富集，代表性方法有深度测序肿瘤个体化建档法(CAPP-Sec)。Newman等19从 肿瘤基因突变数据库找复发突变相关的外显子， 再从肿瘤基因图谱库的 407位非小细胞肺癌患者全基因组测序结果筛选。 然后应用迭代算法使每个非小细胞肺癌 患者样本的错义突变最大化来简化筛选器(selector)的大小，最后的selector能识 别139个

10、复发突变基因中的521个外显子和12个内含子，长度约为125kb,平 均能够识别4个单核苷酸突变(SNV)，在96%的肺腺癌或鳞癌患者身上有效。基于 NGS 技术的检测方法灵敏度高，能同时检测多个基因的多种变异。但是 其技术复杂，数据处理困难，实验室水平差异较大， 仪器与试剂的成本相对较高。想要临床应用，首先要将其标准化 12。4. ARMS 技术ARMS，全称为突变扩增系统(Amplification refractory mutation system)，是由Newton等人首先建立并用于检测基因已知突变的方法20。利用PCR引物3'端碱基必须与其模板 DNA 互补才能进行有效扩增

11、的基本原理，根据已知突变位点设计引物，使 3'末端碱基分别与突变和野生型模板碱基进行互补，实现扩增， 达到将“突变”模板与“野生”模板区分的目的 12。ARMS 法的主要特点有高特异性， 高灵敏度以及耗时短， 成本低， 操作简单等 特点。其检测结果的高特异性关键在于引物设计。 ARMS 法所用的引物是通过筛 选能够识别单个位点等位基因的引物， 进而保证了结果的高特异性。 而 ARMS 法 检测点突变的检出率还取决于 PCR 反应条件的优化和防止引物与靶 DNA 错配 可能发生的错配延伸。PCR反应条件的优化可以通过改变引物浓度、靶 DNA浓度、Taq酶浓度以及反应体系温度进行调整 0】

12、。此外，在反应体系中加入甲酰胺可以减少非特异性扩增，在引物3'末端引入第二个错配碱基也可以提高引物的特异性21。通过在体系中加入多对引物可以实现多重扩增， 实现基因的多位点突 变检测 22。ARMS 法检测灵敏度明显高于直接测序法等其他方法，可检测出样品中含量 低至0.1%1.0%的突变基因；且该方法结合 PCR技术，操作简单，耗时短，成 本低，结果直观 23。目前， ARMS 法已成为国际上肿瘤个体化分子检测最重要、 最先进的技术之一， 其在临床应用中的优势已被业内专家广泛认可。 但该方法只 能用于检测已知突变，在一定程度上限制其应用。ARMS法检测可以分为实时荧光定量 PCR和巢式

13、ARMS法电泳检测。实时荧光定量PCR是指ARMS技术结合探针对扩增产物进行检测，在实时定量PCR平 台上实现对样品 DNA 中稀有突变的检测 24。而巢式 ARMS 法电泳检测是利用 凝胶电泳技术检测扩增带，从而实现结果分析 25。随着ARMS技术的发展，商品化的ARMS试剂盒相继问世，包括人表皮生长 因子受体（EGFR）基因突变检测试剂盒，人KARS基因突变检测试剂盒，四项 耳聋基因检测试剂盒等 13。总结作为重要的肿瘤分子标志物， ctDNA 在肿瘤的诊断、治疗监测、预后等方面发 挥着重要的作用，而 DNA 测序技术的发展使得通过检测 ctDNA 来指导肿瘤的 临床进展变得更加切实可行。

14、数字PCR技术、BEAMing技术、NGS技术、ARMS技术在 ctDNA 的检测中各具其独特的优势和不足之处，实际应用时应结合具体 条件决定采用何种检测方法。相信随着技术的进步， ctDNA 将会逐渐从科研领 域向临床转化发展。参考文献1 Yong E. Cancer biomarkers: Written in blood. Nature, 2014, 511(7511):524.2 Crowley E, Nicolantonio F D, Loupakis F, et al. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood.

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