三维荧光光谱法分类测量水体浮游植物浓度

1、中国环境科学 2008,28(2:136141 China Environmental Science 三维荧光光谱法分类测量水体浮游植物浓度王志刚 1,2, 刘文清 2*, 张玉钧 2, 殷高方 2, 刘建国 2 (1.中国科学技术大学地球和空间科学学院 , 安徽 合肥 230026; 2. 中国科学院安徽光学精密机械研究所 , 中国科学院环境光学与技术重点实验室 , 安徽 合肥 230031摘要:测量了富营养化水体中 13种浮游植物的活体三维荧光光谱和激发荧光光谱 , 通过光谱相似性原则将浮游植物分成 3种光谱组 , 分析 了光合色素组成与各光谱组三维荧光光谱特征的关系 . 选择梅尼小环藻

2、、小球藻和铜绿微囊藻纯种培养体 , 配制 10种不同浓度比例的浮游 植物混合培养体 , 利用平行因子模型算法 (PARAFAC对混合培养体的三维荧光光谱进行了拟合 , 成功地区分了 3种浮游植物组分 . 组分 1(梅 尼小环藻 、 组分 2(小球藻 和组分 3(铜绿微囊藻 在模 1上得分与其在混合样品中的实际相对浓度具有良好的线性关系 , 相关系数分别达到 0.98222, 0.97865和 0.99788, 证实了利用三维荧光光谱和 PARAFAC 模型分类测量浮游植物浓度的可行性 .关键词:浮游植物;三维荧光光谱;平行因子模型;活体荧光中图分类号:X824 文献标识码:A 文章编号:100

3、0-6923(200802-0136-06The classified measuring of three dimensional excitation-emission fluorescence matrix technique on phytoplankton concentration in water body. WANG Zhi-gang1,2, LIU Wen-qing2*, ZHANG Yu-jun2, YIN Gao-fang 2, LIU Jian-guo2 (1.School of Earth and Space Science, University of Scienc

4、e and Technology of China, Hefei 230026, China; 2.Key Laboratory of Environmental Optics and Technology, Anhui Institute of Optics and Fine Mechanics, Chinese Academy of Sciences, Hefei 230031, China. China Environmental Science, 2008,28(2:136141Abstract :Three dimensional excitation-emission fluore

5、scence spectra (3DEEM and excitation fluorescence spectra of 13 kinds of phytoplankton cultures in eutrophied water were measured. The phytoplanktons were sorted to three kinds of spectral group through spectrum similarity principle. Relation between the composition of photosynthesis pigment and the

6、 three dimensional fluorescence spectrum characteristic of each spectral group was analyzed. Selecting purecultures of cyclotella meneghiniana, chlorella vulgaris and microcystis aeruginosa, 10 kinds of phytoplankton mixed cultures with different concentration ratio were made up. The three dimension

7、al fluorescence spectra of mixed cultures were fitted by PARAFAC model and three kinds of phytoplankton components were distinguished successfully. The PARAFAC scores on model 1 of component 1, component 2 and component 3 shows good linear relationships with the real relative concentrations of cyclo

8、tella meneghiniana, chlorella vulgaris and microcystis aeruginosa in mixed cultures respectively, the linear relative coefficients are 0.98222, 0.97865 and 0.99788, proving actually the feasibility of classified measuring phytoplankton concentration using three dimensional fluorescence spectrum and

9、PARAFAC model.Key words:phytoplankton ; 3DEEM ; PARAFAC ; in vivo fluorescence水体富营养化导致浮游植物过量增殖 , 导致 “水华暴发” , 是当前世界范围内的水污染问题 . 监测浮游植物种类和浓度的时空变化 , 尤其是对 有毒藻类进行及时预警是降低损失最有效的手 段之一 1-2. 因此 , 浮游植物种类和浓度的快速监 测已经成为环境监测部门的一项重要任务 . 传统 浮游植物浓度的测量一般通过现场采样、 实验室 分析完成 , 实验室分析手段主要包括分光光度 法、 高效液相色谱法 (HPLC和显微观察计数法 3. 这些方

10、法大多由于步骤繁琐、 成本昂贵以及需要 专业检测人员等原因而难以普及应用 .国内外研究者针对该问题开展了多项研究 , Moberg 等 4利用主成分分析算法 (PCA和偏最 小二乘拟合 (PLS研究了浮游植物吸收光谱 , 初收稿日期:2007-05-23基金项目:中国科学院知识创新工程方向项目 (KGCX2-SW-111;安 徽省人才培养及科研带头人专项基金* 责任作者 , 研究员 , wqliu2期 王志刚等:三维荧光光谱法分类测量水体浮游植物浓度 137步探讨了基于吸收光谱的浮游植物种群鉴别和 浓度定量分析方法 .Millie 等 5-6基于浮游植物的 吸收光谱 , 利用 “逐步识别分析”

11、 和相似指数 (SI对不同辅助色素组成的浮游植物种群进行了区 分 .Yentsch 7等根据辅助色素和叶绿素吸收产生 的叶绿素 a 荧光比例 , 将浮游植物分成 4大类 . 张 前前等 8-11利用 PCA 分析算法 , 研究了浮游植物 活体吸收光谱和三维荧光光谱分类判别方法 . 荧光光谱法具有灵敏度高、光谱特征性好等 优点 , 是目前原位测量浮游植物叶绿素 a 浓度的主 要手段 . 德国 W ALZ 公司采用调制技术 , 利用 4种 不要波长的 LED 作为光源 , 利用光电倍增管作为 检测器 , 实现了水样中的蓝藻、绿藻、硅藻 /甲藻 自动分类 , 并分别测量它们的叶绿素含量和光合 活性

12、. 不足之处是检测藻类种类少 , 对某些藻类无 法很好地进行区分 12-13. 较传统的二维荧光光谱 而言 , 三维荧光光谱包含了更丰富的光谱信息 , 已 经被用于活体浮游植物的分类判别研究中 9-11, 但 对混合浮游植物浓度进行分类测量的研究相对 较少 . 基于此 , 本实验通过研究 13种淡水富营养化 优势浮游植物的活体三维荧光光谱 , 根据其光谱 特征将浮游植物进行光谱分类 , 平行因子算法模 型 (PARAFAC对不同光谱组的混合浮游植物三 维荧光光谱进行了拟合分析 , 得出了不同光谱组 藻类的在混合样品中相对浓度 . 以期为利用活体 三维荧光光谱进行浮游植物浓度原位分类快速 测量提

13、供新的思路 .1实验部分1.1 浮游植物培养实验所选的 13种浮游植物由中国科学院水 生生物研究所淡水藻种库提供 , 其中蓝藻门 4种 , 分别为铜绿微囊藻 (Microcystis aeruginosa 、 聚球 蓝藻 (Synechococcus sp 、 绿色微囊藻 (Microcystis vridis 和惠氏微囊藻 (Microcystis wesenbergii, 绿 藻门 6种 , 分别为小球藻 (Chlorella vulgaris 、四 尾栅藻 (Scenedesmus quadricanda 、斜生栅藻 (Scenedesmus obliqnus 、双形栅藻 (Scened

14、esmus dimivphus 、球状栅藻 (Scenedesmus bijujatus 和 莱茵衣藻 (Chlamyclomonas reinhardtii; 硅藻门 3 种 , 分别为梅尼小环藻 (Cyclotella meneghiniana 、 汉 氏 菱 形 藻 (Nitzschia hantzschiana 和 脆 杆 藻 (Fragilaria sp.在光照培养箱中进行纯种培养 , 固 定光暗周期为 10h/14h,温度为 25/22 , 光照强度 为 6000 lx,培养周期为 15d. 蓝藻门、绿藻门、硅 藻门浮游植物分别使用 BG -11、 SE 、 D1培养基 . 1.2

15、活体荧光光谱测量在培养周期 15d 结束后 , 立即取 13种浮游植 物液态活体培养体 , 以蒸馏水稀释至叶绿素 a 浓 度为 100g/L.将各稀释培养体暗适应 2h, 用 Fluorolog3-TAU -P(JOBIN YVON,法国 稳态 /瞬态荧光光谱测量系统测量上述 13种浮游植物 稀释培养体活体三维荧光光谱 , 系统采用 450W 氙灯作为激发光源 , 光谱分辨率为 0.2nm, 光谱检 测 范 围 为 200900nm,信 噪 比 为 4000:1(纯 水 397nm 拉 曼 峰 . 测 量 激 发 波 长 范 围 设 定 为 450650nm,发射波长范围为 470750nm,

16、激发、 发射波长间隔分别为 5nm 和 1nm. 同时测量上述 样品 684nm 发射波长的激发荧光光谱 , 激发波长 范围 350650nm,激发波长间隔为 1nm.表 1混合浮游植物培养体配制Table 1 Ratio of three phytoplankton species in mixed phytoplankton cultures样号铜绿微囊藻小球藻梅尼小环藻样号铜绿微囊藻小球藻梅尼小 环藻1 5 10 6 5 15 252 7 20 10 153 8 5 20 204 9 5 10 305 15 5以铜绿微囊藻、 小球藻和梅尼小环藻的上述 稀释培养体配制 10种不同混合比例的

17、培养体 , 配制比例如表 1, 测量其三维荧光光谱 , 方法同浮 游植物稀释培养体三维荧光光谱测量 .1.3荧光光谱数据处理Rayleigh 散射是水分子的弹性散射 , 波长与 激发光相同 , 对浮游植物活体三维荧光光谱的干 扰很大 . 采用将激发光波长20nm 范围内荧光 强度置零的办法去除 Rayleigh 散射的影响 .138 中 国 环 境 科 学 28卷Raman 散射则是水分子的非弹性散射 , 通过减去 测 得 的 蒸 馏 水 三 维 光 谱 消 除 其 影 响 . 将 去 除 Rayleigh 散射和 Raman 散射后的浮游植物三维 荧光光谱数据组合成三维数据矩阵 , 利用 m

18、atlab 软件 (version 6.5, Mathworks Inc绘制成三维荧 光等高图 .激发荧光光谱数据以最大发射荧光强度进 行归一化 , 根据归一化的荧光光谱数据绘制激发 荧光光谱图 .1.4 PARAFAC 模型拟合方法将 10个去除 Rayleigh 散射和 Raman 散射影 响的混合浮游植物三维荧光光谱数据按照样品编 号、发射波长和激发波长的顺序组合成三维数据 阵列 (1028141. 采用 “ N 维工具箱” 在 matlab6.5 (美国 Mathworks 公司 上对该三维数组进行PARAFAC 模型分析 , 参数设制采用默认 值 14.2 结果与讨论2.1 浮游植物

19、的活体三维荧光光谱特征浮游植物细胞内吸收光能的色素主要有光 合色素叶绿素 a 和辅助光合色素 , 叶绿素 a 存在 于任何浮游植物中 , 叶绿素荧光主要由光合系统 (PS 的叶绿素 a 产生 . 辅助光合色素在活体 藻类细胞内以捕光复合体的形式存在 , 作用是吸 收光能 , 将其传递至叶绿素 a, 最终到达光合反应 中心 . 由于不同种类的浮游植物 PS 的辅助光合 色素组成不同 , 导致产生不同形状的荧光光谱 15. 图 1给出了全部浮游植物活体三维荧光光谱 , 从 上至下顺序依次为蓝藻门 4种 (14,绿藻门 6种 (510,硅藻门 3种 (1113.(1 铜绿微囊藻620 600 580

20、560 540520 500480 460600 发射波长 (nm 激 发 波 长 (n m 650 700750 650 600550500 450 (2聚球蓝藻 600 650 700 750发射波长 (nm650600550500450600650700750(3绿色微囊藻 发射波长 (nm650600550500450发射波长 (nm600650700750(4惠氏微囊藻620 600560 580540 520 500 480 460(5小球藻 发射波长 (nm600 650 700 750650 600 550 500450(6四尾栅藻发射波长 (nm600 650 700 750

21、激 发 波 长 (n m 650 600 550 500450(7斜生栅藻 600 650 700 750发射波长 (nm650600550500450600650700750发射波长 (nm(8双形栅藻650600550500450600650700750 发射波长 (nm(9球状栅藻650 600 550 500450(10莱茵衣藻发射波长 (nm600 650 700 750650 600 550 500 450500 550 600 650 700750发射波长 (nm(11梅尼小环藻激 发 波 长 (n m 650600550500450(12汉氏菱形藻发射波长 (nm6006507

22、00750650600550500450(13脆杆藻发射波长 (nm600650700 750图 1 浮游植物活体三维激发发射荧光光谱Fig.1 Three dimensional excitation-emission matrices of in vivo phytoplankton2期 王志刚等:三维荧光光谱法分类测量水体浮游植物浓度 139由图 1可见 , 绿藻门 6种浮游植物的三维荧光光谱高度相似 , 均具有 3个激发 /发射荧光中心435nm/684nm, 470nm/684nm,490nm/684nm.绿藻门浮游植物含有的辅助光合色素为叶绿素 b 和类胡萝卜素 , 叶绿素 b 的

23、最大吸收在 470nm 左右 ,相应的类胡萝卜素最大吸收通常在 490nm, 叶绿素 a 的吸收峰则在 435nm 15-16. 由此可以判定435nm/684nm和 490nm/684nm的荧光中心分别由 叶 绿 素 a 和 类 胡 萝 卜 素 的 吸 收 产 生 ,470nm/684nm荧光中心由叶绿素 b 吸收产生 . 蓝藻门浮游植物的辅助色素为蓝藻色素蛋白 , 最大吸收在 610nm 左右 , 最大荧光发射波长是 660nm.与此一致 , 蓝藻门浮游植物三维荧光光谱含有 2个荧光中心 , 分别为 610nm/660nm, 610nm/684nm.硅藻门的浮游植物的辅助色素为叶绿素 c

24、和多种类胡萝卜素 , 叶绿素 c 的最大吸收位于 460nm 左右 , 因此具有 435nm/684nm的叶绿素 a 主荧光中心和 460nm/684nm的叶绿素 c 荧光中心 , 此外根据所含类胡萝卜素的种类不同 , 在 480580nm波长范围出现不同的次级荧光中心 .综上可见 , 浮游植物的活体三维荧光光谱决定于所含辅助色素的种类组成 . 相似辅助色素组成的浮游植物具有非常类似的三维荧光光谱 . 由此 , 根据三维荧光光谱的特征将所选 13种浮游植物分成 3类光谱组 , 见表 2.表 2浮游植物光谱组分类Table 2Spectral groups of phytoplankton光谱组

25、 辅助色素组成 藻 类绿色组 叶绿素 b 、 类胡萝卜素小球藻、四尾栅藻、 斜生栅藻、双形栅藻、 球状栅藻、莱茵衣藻蓝色组 藻蓝色素蛋白 惠氏微囊藻、绿色微囊藻、 铜绿微囊藻、聚球蓝藻属褐色组 叶绿素 c 、 类胡萝卜素 梅尼小环藻、汉氏菱形藻、 脆杆藻属2.2浮游植物活体激发荧光光谱特征与三维荧光光谱相似 , 浮游植物激发荧光光 谱反映了辅助光合色素组成的差异 , 可以用来作 为浮游植物光谱分类的依据 . 由图 2可见 , 绿色组 浮游植物 435nm/684nm的叶绿素 a 激发荧光峰 和 490nm/684nm的类胡萝卜素激发荧光峰 ; 蓝藻 门浮游植物最大激发荧光峰为 610nm/68

26、4nm,由 藻 蓝 蛋 白 吸 收 产 生 ; 硅 藻 门 浮 游 植 物 除 435nm/684nm的叶绿素 a 荧光峰外 , 在 480 580nm 范围内有一系列小荧光峰出现 , 主要由类 胡萝卜素产生 , 其中梅尼小环藻和汉氏菱形藻明 显在 530nm 处出现荧光峰 , 与类胡萝卜素中的岩 藻黄质的吸收峰一致 15-16.1.00.20.0350400450500 550 600 650归一化荧光强度 (684nm斜生栅藻双形栅藻球状栅藻莱茵衣藻四尾栅藻1.000.750.500.250.00铜绿微囊藻聚球蓝藻绿色微囊藻惠氏微囊藻350400450500 550 60

27、0 650归一化荧光强度 (684nm1.00.20.0归一化荧光强度(nm梅尼小环藻汉氏菱形藻脆杆藻350400450500 550 600 650 激发波长 (nm图 2 浮游植物的激发荧光光谱Fig.2 Excitation fluorescence spectra of in vivo phytoplankton2.3混 合 浮 游 植 物 三 维 荧 光 光 谱 数 据 的 PARAFAC 模型分析在化学计量学中 ,PARAFAC 是针对混合样140 中 国 环 境 科 学 28卷品多维测量数据分析的一种新近发展起来的模 型 , 其本质是 PCA 模型在三维及其以上

28、空间中应 用的扩展 , 最终的分析目的是根据一系列不同混 合样品中各混合组分浓度比例的差异将混合样 品中各组分分离出来 , 得到纯的各组成组分的测 量信息 , 具体实现方法是通过交替最小二乘 (ALS拟合出各个模上 (模对应于多维数据阵列中的维 的得分载荷 , 不同模上的得分载荷对应不同的测量信息 16-17.对实验测得的 10种不同混合比例的浮游植 物 混 合 样 品 的 三 维 荧 光 光 谱 数 据 阵 列 进 行 PARAFAC 模型拟合 , 根据 PARAFAC 模型原理 , 模 1得分载荷即为样品中浮游植物各组分的得 分值 , 该得分值与浮游植物组分浓度线性正相关 ; 模 2得分载

29、荷为各浮游植物组分在发射波长上 的得分 , 对应于发射荧光光谱 ; 模 3得分载荷为各 浮游植物组分在激发波长上的得分 , 对应于激发 荧光光谱 . 图 3为利用 PARAFAC 模型拟合得到 的 3种浮游植物组分的三维荧光光谱 .650 600 550 500450 600 650 700 750发射波长 (nm激 发 波 长 (n m 组分 1650 600 550 500450 600 650 700 750发射波长 (nm组分 2650 600550 500450600 650700750发射波长 (nm组分 2组分 3图 3 PARAFAC模型拟合所得 3种藻类组分的三维荧光光谱Fi

30、g . 3 Three dimensional excitation-emission matrices of three phytoplankton componentsfitting by PARAFAC model图 3中组分 1、 组分 2和组分 3的三维荧光光谱分别与混合样品中所含的梅尼小环藻、 小球藻和铜绿微囊藻的三维荧光光谱极为类似 (图 1,同时由拟合得到模 2和模 3上的各组分得分载荷可以看出 , 组分 3的最大发射峰大约位于 660nm 处 , 最大激发波长大约在 610nm, 与藻蓝蛋白的荧 光发射峰一致 , 组分 1和组分 2的最大荧光发射 峰则在 684nm 左右 .

31、 由此可以判断 PARAFAC 模 型成功拟合得到了 3种浮游植物组分的纯光谱 , 拟合出的组分 1、组分 2、组分 3分别为梅尼小 环藻、小球藻和铜绿微囊藻 .利用模 1上各组分在样品中的得分值可以反 映出各浮游植物组分在各样品中的相对浓度 . 图 4给出了各样品中 3种浮游植物组分模 1上的得分 值与其混合在样品中的实际相对浓度的线性拟 合结果 .0.1梅尼小环藻R =0.98222 N =10 P 0.000112345678得分值 (105相 对 浓 度 (%模 1模 2铜绿微微囊藻 R =0.99788 N =10 P 0.0001123 4 5

32、得分值 (1050.450.400.350.3050.10相 对 浓 度 (%模 31234 5 6 7 得分值 (105 小球藻R =0.97865 N =10 P 0.000相 对 浓 度 (%图 4 3种植物组分第一维得分值与相对浓度拟合Fig.4 Linear regression of scores on model 1 and relativeconcentration of three phytoplankton 梅尼小环藻、小球藻和铜绿微囊藻的得分值 与实际相对浓度均存在良好的线性关系 , 线性相2期 王志刚等：三维荧

33、光光谱法分类测量水体浮游植物浓度 谱学与光谱分析, 2006,26(9:1676-1680. 141 关系数分别为 0.98222, 0.97866 和 0.99788,可见 PARAFAC 模型模 1 的得分载荷准确地反映了各 浮游植物组分在混合样品中的实际浓度.若通过 标准方法测量得到各浮游植物组分实际浓度与 相应测量得分值的线性关系,则可以通过 PARAFAC 模型拟合得到的组分得分值准确地计 算出混合样品中各浮游植物组分的实际浓度. 3 结论 9 张前前,类淑河,王修林,等.浮游植物活体三维荧光光谱分类判 别方法研究 J. 光谱学与光谱分析, 2004,24(10:1227-1229.

34、 10 张前前 , 类淑河 , 王修林 , 等 . 浮游植物活体三维荧光特征提取 J. 高技术通讯, 2005,15(4:75-78. 11 Zhang Qian-Qian, Lei Shu-He, Wang Xiu-Lin, et al. Discrimination of phytoplankton classes using characteristic spectra of 3D fluorescence spectra J. Spectrochimica Acta Part A, 2006,63(2:361-369. 12 Schreiber U. Chlorophyll fluor

35、escence: new instruments for special applications A/Photosynthesis: mechanisms and 3.1 测量了 13 种淡水优势浮游植物活体三维 荧光光谱和激发荧光光谱,分析了活体荧光光谱 特征与细胞包含光合色素间的关系. 3.2 基于活体荧光光谱特征,将淡水浮游植物 分成 3 类光谱组,绿色组、蓝色组和褐色组. 3.3 利用三维荧光光谱结合 PARAFAC 模型,实 现了对混合浮游植物样品中各浮游植物组分的 准确测量,为水体浮游植物浓度的原位、分类测 量提供了一种新的方法. 参考文献： 1 Sellner K G, Dou

36、cette G J, Kirkpatrick G J. Harmful algal blooms: causes, impacts and detection J. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2003,30(7:383-406 2 Robbins I C, Kirkpatrick G J, Blackwell S M. Improved monitoring of HABs using autonomous underwater vehicles (AUV J. Harmful Algae, 2006,5(6:7

37、49-760 3 国家环境保护总局水和废水监测分析方法编委会.水和废 水监测分析方法 M. 北京:中国环境科学出版社, 2006:649- effects(V C. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 1998: 4253-4258. 13 Kolbowski J, Schreiber U. Computer-controlled phytoplankton analyzer based on 4-wavelengths PAM chlorophyll fluorometer A/Photosynthesis: from light to Biosphere(V C. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 1995:825-828. 14 Andersson C A, Bro R. The N-way toolbox for MatLAB J. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, 2000,52(1: 1-4. 15 Poryvkina L, Babichenko S,