高效液相色谱培训HPLC使用与维护ppt课件

1、脱气装置四元泵检测器柱温箱样品盘控温箱流动相启动液相色谱仪器的流程 l开启HPLC系统各个设备的电源打开泵、自动进样器、检测器电源，待设备通过自检后，打开计算机启动色谱管理软件l准备流动相过滤，脱气l色谱泵排气用新配制的流动相灌注泵 色谱泵自动进样器 检测器废液数据处理系统 pH变化值0.1RS变化值1.6色谱柱：Zorbax StableBond C18 4.6*250mm,5um 流动相：27%甲醇：73%磷酸 pH： 2.5&2.6温度： 50流速： 1.0mL/min. 按流动相组成分：单组分和多组分 按极性分：极性、弱极性、非极性 按使用方式分：等度洗脱和梯度洗脱 不管采用何

2、种途径，配制流动相应用新鲜水，水质要求越高放置时间越短。 理想的HPLC用水应为18.2的超纯水，并通过0.22um的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及空气等。 过滤与脱气过滤与脱气流动相的保存l有机溶剂流动相：室温下密封，避光保存l缓冲盐流动相：当日现配现用：低温下密封保存，一般不超过3天防止微生物生长l有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相：低温密封保存防止有机相的挥发l选用适宜的容器（1）改善分离, 加快分析速度；（2）改善峰形, 减少拖尾, 有利于痕量组分的检测；（3）增加峰容量；（4）强烈滞留的组分不容易残留在柱上, 保持柱性能长期良好；（5）下次分析时, 流动相需要一段平衡时间；不同溶

3、剂的UV吸收程度稍有差异, 可能会引起基线漂移 A 流动相/弱溶剂组成； B 流动相/强溶剂组成； 梯度时间； 梯度曲线：线性、凸型或凹型等。强溶剂 A%time125123死体积/谱带展宽体积(无色谱柱时)滞后(系统)体积滞后(系统)体积溶剂输送系统(泵)检测器进样器色谱柱色谱柱梯度混合器溶剂输送系统(泵)高压梯度注意注意滞后体积包括进样器、阻尼滞后体积包括进样器、阻尼 器、混合器及其管路器、混合器及其管路比例阀检测器进样器ABCD色谱柱色谱柱溶剂输送系统(泵)低压梯度 阻尼器 混合器滞后体积变化的影响设计不好的HPLC系统，滞后体积随反压变化滞后体积随反压变化的后果：梯度的准确性不好，造成

4、：方法的适应性不好用静态梯度混合器；固定滞后体积可明显改善梯度特性梯度百分比保留时间梯度曲线好的梯度滞后曲线保留时间梯度百分比不好的梯度滞后曲线固定滞后体积，改善了梯度性能普通的低压梯度系统液相色谱的色谱柱色谱柱的连接 Stop_depth长度不合适造成柱前死体积 锥箍锥度不合适造成渗漏 色谱柱的连接 l除去柱上端固定相变色部分 (约3mm左右)，再补充新的固定相。 l色谱柱吸附未被洗脱成分时，柱效将明显下降，选合适的溶剂进行洗净。 l采用梯度洗脱时，柱在重复使用前，用泵把几倍于柱体积的起始溶剂压经柱子，以重新建立起始的平衡来得到再生。可能提高柱效的方法6:1NSAU0.000.050.100

5、.15Minutes0.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.00Parabens at 254 nmUV Spectrum of Eluents with 0.1% TFA Against HPLC Grade H2O BlankAU0.000.100.200.300.400.500.600.700.800.901.001.101.201.301.401.50nm200.00210.00220.00230.00240.00250.00260.00270.00280.00290.00H20 with 0.1% TFA50% ACN with 0

6、.1% TFA色谱条件色谱柱：C18, 5 m, 3.9x150mm at 35 C.流动相： A: 0.1% TFA in Water.B: 0.1% TFA in Acetonitrile.梯度： 5 - 40% B in 35 min.流速： 1.0 mL/min.样品： 水（10 L inj. vol.）检测： 214 nm 图1；好的梯度系统 图2；一般的二元梯度系统 图3；一般的四元梯度系统五个小肽的5ng进样，好的色谱系统非常容易鉴别出所有峰。在不好的色谱系统中，第一个峰则消失在基线噪音中。1.2241.1831.183Caffeine 271 nm吸滤头单向阀柱塞密封圈线路过滤器进样器检测器吸滤头吸滤头单向阀单向阀线路过滤器线路过滤器排液阀压力传感器线路过滤器流动相单次样品运行时间单次样品运行时间 = 分析时间分析时间 + 色谱柱平衡时间色谱柱平衡时间色谱柱平衡时间色谱柱平衡时间 = 10倍柱内体积倍柱内体积 流速流速4.6 x 500.5 mL5 min4.6 x 300.3 mL3 min4.6 x 150.15 mL1.5 min4.6 x 1501.54 mL15 min2.1 x 500.10 mL5 min60 sec2.1 x 300.06 mL3 min36 sec2.1 x 150.03 mL1.5 min18 sec色谱柱色谱