pigletmodelSubchondralfractureafterischemicosteonecrosis

1、Subchondral fracture after ischemic osteonecrosisof the immature femoral head in piglet model 进行该实验研究以研究使用仔猪模型的未成熟股骨头的缺血性骨坏死后软骨下骨折的发展。 在将结扎紧紧地放置在股骨颈周围以破坏股骨头的血液供应之后，研究了48只雄性仔猪。 在局部缺血诱导后2-8周对动物实施安乐死。进行射线照相，组织学和组织形态学评估。 在缺血性坏死的初始放射照相阶段的32个梗死的股骨头中的12个（38）中观察到软骨下骨折。 骨折主要见于那些血运重建和修复开始的初始阶段的股骨头。组织形态计量评估显示，

2、与对侧正常头相比，梗塞股骨头的软骨下区域的小梁厚度和体积减小。 在缺血性骨坏死后，软骨下区域中的小梁骨更薄，并且由于缺乏新的骨形成而存在更少的骨体积。 这项研究的结果支持这一假设，未成熟股骨头的软骨下骨折发展为软骨下区域中的小梁骨结构改变的结果。 Introduction 新月形软骨下射线可见线的出现是Legg-Calve-Perthes病1,2中最早的放射学标志之一。 导致新月体征的软骨下骨折的发展被认为是从真性形态区分潜在perthes病形式的关键病理学事件3,4。 虽然已经对在髋关节置换术时获得的梗塞的成年股骨头进行了广泛的研究5-9，但是由于缺乏病理标本的可用性，对未成熟的股骨头也不可

3、能进行类似的研究。 结果，未成熟股骨头缺血性坏死后这一重要事件的意义仍不清楚。Salter 3和Salter和Thompson 4提出，在Perthes病中，软骨下骨折的发生是坏死骨再吸收的结果，并且在梗塞的骨性骨骺骨化后恢复扁织骨。 据信，修复过程通过产生编织骨而削弱软骨下区域的承重能力，所述编织骨在受到与正常有力活动相关的负荷时断裂。 据我们所知，在文献中只有一项研究提出了关于未成熟股骨头中软骨下骨折发展的所有科学数据。在缺血性坏死的仔猪模型中，Douglas和Rang 10在血管再生的部位观察到软骨下骨折。 他们没有报告骨吸收或编织骨形成是否与骨折的发展相关。 除了这些数据，缺乏数据来支

4、持或反驳缺血性骨坏死后未成熟股骨头中软骨下骨折的所提出的机制。由于软骨下骨折的发展可能是预示由于缺血性骨坏死而复杂的perthes病和其他髋部病变中的股骨头畸形的发展的关键事件，因此定义有助于其发展的过程是重要的。 定义这些过程可能揭示潜在的治疗策略，可以早期应用以防止股骨头畸形的发展。 因此，我们使用仔猪模型进行详细的射线照相和组织学研究，以调查未成熟股骨头的缺血性骨坏死后软骨下骨折的发展。Materials and methods 实验研究由机构动物护理和使用委员会批准。 使用4-6周龄（6-9kg）的雄性约克夏小猪。 如前所述11，通过手术将结扎线紧紧地放置在股骨颈周围来诱发股骨头骨骺的

5、缺血性骨坏死。 所有动物用戊巴比妥过量安乐死。在诱导局部缺血后，在第2周处死10只动物，在第3周处死3只动物，在第4周处死12只动物，在第6周处死3只动物，并在第8周处死20只动物。 切除近端股骨，并使用Faxitron Cabinet X射线系统（Hewlett-Packard，McMinville，Oregon，USA）作为整体进行射线照相。 然后使用精密圆形金刚石锯（Isomet 1000; Buehler，Lake Bluff，Illinois，USA）将股骨头在冠状面中切成3mm厚，并进行射线照相以产生断层图像。 将对侧作为对照。Histological procedure 将股骨头

6、部分在真空下固定在10中性缓冲福尔马林中。 组织学切片的产生和检查，如前所述11,12。 将来自每个头部的一半切片转移到EDTA溶液中用于脱钙和石蜡包埋。 将剩余的部分置于一系列用于甲基丙烯酸甲酯包埋的分级乙醇溶液中。 将石蜡块切成5mm厚并用苏木精和曙红染色。 将塑料块在雪犁切片机上切成4mm厚，并根据von Kossa和McNeals四色染色用5硝酸银染色。Histomorphometry 用von Kossa和McNeal的四色染色染色的切片用于确定美国骨和矿物研究学会采用的小梁指数13。 使用来自每只动物的股骨头的中心区域的代表性切片。 为了根据平行板模型确定小梁骨体积，组织体积，小梁

7、分离，小梁厚度和小梁数， 使用Bioquant图像分析系统（Bioquant Image Analysis Corporation，Nashville，Tennessee，USA）测量组织面积，骨面积和小梁周长。根据美国骨与矿物研究协会13批准的指南计算得到的指数。 在距软骨 - 骨连接处1mm的距离内进行测量，以在骨骺的软骨下区域中包括初级和次级海绵。Statistical analysis 使用配对t检验（双侧）分析来自梗塞和对侧正常头的小梁指数。 小于0.05的P值被认为是统计学显着的。 所有数据表示为平均值标准偏差Results 所有48个股骨头显示缺血性骨坏死的射线照相证据。 在48

8、个梗塞的股骨头中，32个股骨头具有较小的骨性核，在射线照相评估中具有轻度或无股骨头变平。 这些股骨头被分类为处于缺血性骨坏死的初始阶段，并且评估是否存在射线照相新月征（图1）和软骨下骨折的组织学证据（表1）。剩余的16个股骨头具有中度至重度扁平的股骨头与骨吸收和形成在骨骺内的区域，在放射学评估时其具有碎片外观。 这些股骨头被分类为处于碎裂（吸收）阶段。（a） 在缺血性坏死的诱导后4周，通过股骨头骨骺中心的3毫米厚的截面。 梗死的股骨头显示在右边，并且由于缺血性骨坏死和缺乏修复和血运重建而具有浅色的骨质骨。 注意，与左侧所示的非梗死的头相比，梗塞侧上的骨骺软骨变厚，骨化核较小，表明生长停止。 可

9、以看到骺软骨与下面的软骨下骨之间的分离。 （b）在（a）新月体征中所示骨骺的中央，三毫米厚的冠状切片的放射照片在梗塞的股骨头（右） 在初始阶段的股骨头在外科诱导缺血后4周内（32只中的24只）主要在动物中观察到（表1）。 在局部缺血诱导后6-8周，主要在动物中观察到断裂阶段的股骨头。在缺血性骨坏死的初始阶段，32个股骨头中有12个具有软骨下骨折的组织学证据（表1）。 骨折被看作是骺软骨肥厚区和软骨下区的主要海绵之间的间隙或通过主要海绵体的小梁碎裂。 在软骨下区域观察到具有坏死碎片的小的碎片小梁，这表明这是由于机械负荷的结果。在该区域中没有观察到编织骨或新骨形成，并且在具有软骨下骨折的所有梗塞头

10、部中没有成骨细胞排列在小梁内。 在具有软骨下骨折的组织学证据的12个头部中的7个显示出射线照相新月形标志。 具有软骨下骨折的组织学证据的大多数股骨头来自仍然处于局部缺血诱导后8周的缺血性骨坏死的初始阶段的那些股骨头。 八个股骨头中有七个在局部缺血诱导后8周出现软骨下骨折后仍处于骨坏死的初始阶段。在具有软骨下骨折的12个股骨头中，3个在骨骺中没有显示出血运重建或修复的迹象。 这三个股骨头来自在局部缺血诱导后2-4周安乐死的动物。 七个股骨头有纤维血管组织侵袭的骨骺。 即使在这些头部中也没有新的骨形成，并且修复组织仅存在于软骨下骨折的周围（图2）。 剩余的两个股骨头显示沿着骨折部位的整个长度存在纤

11、维血管组织。 没有新骨或编织的骨形成。缺血损伤对股骨头软骨下区域的影响使用组织形态学测量，在缺血诱导后4周没有软骨下骨折的七个头中定量评估（图3）。 由于具有软骨下骨折的头部具有严重的小梁碎裂和解体，它们不能定量评估。 随着由缺血性损伤引起的软骨内骨化的停止，由于成骨细胞和破骨细胞的死亡，在原发松质骨上不存在新的骨形成和骨重建。与对侧正常侧相比，梗塞侧的软骨下区域的组织形态计量评估显示平均小梁厚度和骨体积分数显着降低（两者的P 0.01，表2）。 与对侧正常侧相比，梗塞侧的平均小梁数增加（P = 0.05）。 在平均小梁分离中没有观察到显着差异。（a） 局部缺血诱导8周后来自梗塞股骨头的切片的

12、低倍放大显微照片。 在骨性骨骺周围（苏木精和曙红染色，5）观察到由纤维血管组织侵入的存在所证实的血运重建。 （b）骨折骨膜周边的高倍放大显微照片，其中在骨折部位附近看到纤维血管组织侵入（箭头）（苏木精和伊红染色，40）Discussion 研究显示一些未知的未成熟股骨头的软骨下骨折的发展的观点。 虽然众所周知，缺血性骨坏死损伤骨软骨下生长板、软骨周围骨软骨、软骨内骨化11,14,15，其对软骨下区骨质结构的影响尚未在未成熟的 股骨头研究。我们的研究结果表明，梗死头部中的软骨内骨化的停止导致存在于软骨下区域中的未成熟小梁（原发性骨质疏松）的量与正常对侧股骨头相比减少。 此外，梗塞的头部中的未成熟

13、小梁保持较薄，因为没有新的骨形成和重塑。 由于细胞死亡，通常包围钙化软骨和未成熟小梁以产生新骨和增加小梁厚度的成骨细胞不存在。可能的是，结构变化降低了梗塞股骨头中的软骨下区域的机械性质。 此外，必须记住，尽管在疾病过程的早期阶段在梗塞侧没有新的骨形成和生长，但是在对侧正常侧上持续的骨形成和生长，这有助于骨小梁结构之间更大的差异 双方。 这些小梁差异以及生长中的机械负荷很可能有助于软骨下骨折的发展。（a）来自非梗死股骨头的软骨下区域的显微照片。 钙化的软骨（蓝色）被新骨（粉红色）和成骨细胞（箭头）包围，产生原发性骨质疏松和末成熟小梁的增厚。 （b）局部缺血诱导4周后来自对侧，梗塞股骨头的软骨下区

14、域的显微照片。 没有成骨细胞排列钙化软骨和原发松质骨附近，没有新骨形成（箭头）。 注意，与（a）中所示的对侧非梗死侧相比，存在的原发松质骨量和更薄的小梁的量减少。 显微照片在相同的放大倍数（苏木精和伊红染色，100）下获得。本研究的组织形态学结果支持了早期使用仔猪模型进行机械研究的结果16,17。 在缺血诱导后2周，修复过程尚未开始的时间点，梗死的股骨头的压痕测试显示与对侧正常股骨头相比，压缩刚度降低5217。 类似地，梗塞股骨头的骨芯的机械测试分别显示出与缺血后诱导2周时对侧正常骨芯相比，骨模量和屈服应力分别降低了59和4616。总之，这些研究支持这样的假设：未成熟股骨头中的软骨下骨折由于在

15、软骨下区域中受损的小梁骨的机械性失效而发展，而不是由于修复过程或新的编织骨形成 。 最近使用定量反向散射电子成像的骨矿物质密度分布的研究提供了在疾病过程的早期和软骨下骨折的发展中的机械强度丢失的进一步解释18。在该研究中，在软骨下区域观察到坏死性小梁的高度矿化。 在仔猪模型中诱导缺血后4周，发现梗塞股骨头的软骨下区域具有矿化的显着增加（分别为平均和峰值矿化增加23和17）和增加的同质性， 导致更脆的骨，将更容易受影响致微骨折。我们的研究表明，不是所有梗死的股骨头发展软骨下骨折。 在该实验模型中，软骨下骨折似乎优先发生在那些具有延长的缺血性骨坏死的初始阶段的股骨头中。 八个梗死的股骨头中的七个在

16、缺血诱导后8周仍处于初始阶段时具有软骨下骨折。 这些股骨头中的血管重建和再吸收被延迟，因为这个模型中的大多数股骨头此时进入了碎裂阶段。由于软骨下区域被机械损伤，如果初始阶段持续更长的持续时间，则软骨下骨折的风险将更高，因为缺乏坏死骨修复正常机械负荷下发生的微裂缝的能力。 骨坏死的较长初始阶段将导致这些微裂缝在该区域中更大的积累，这可能最终导致表现为软骨下骨折的结构性破坏。在这些梗死的头部中，没有血管重建和再吸收的延迟，股骨头最可能通过再吸收区域变形，并且不会发展软骨下骨折。 在这些情况下，股骨头畸形的发展可能不在软骨下骨折之前。我们的结果与以下假说相矛盾：软骨下骨折发展是新的编织骨形成的结果，

17、其在修复阶段机械地劣于天然层状骨。 在我们的研究中，没有发生软骨下骨折的梗死性股骨头在骨折区域具有新的骨形成。 软骨下骨折发生在软骨下区域的新骨形成开始之前。作为血管重建的结果而出现软骨下骨折和在软骨下区域中存在纤维血管组织的假设是有争议的。 在那些在缺血诱导后2-4周发现具有软骨下骨折的三个股骨头中完全没有血管重建。 在大部分具有在局部缺血诱导后8周的软骨下骨折的股骨头中，在骨折部位的外周末端仅观察到少量的纤维血管组织侵入。 这是可能的血运重建和早期骨吸收在骨折的周边开始的。然而，从本研究中的组织形态学研究结果，没有血运重建的一些股骨头发现软骨下骨折，以及更早机械的研究16,17的梗死股骨头支持这一假设血运重建和吸收不起作用 在软骨下骨折的发展中。总之，这项研究提供了一种新的见解缺血性坏死后未成熟股骨头的软骨