白菜 WRKY 转录因子 cDNA 全长的克隆及分析

1、农业生物技术学报 JournalofAgriculturalBiotechnology2007,15(5):810815 · ·研究论文白菜 WRKY 转录因子 cDNA全长的克隆及分析 * 王彦华 1 , 侯喜林 2 *,申书兴 12.南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室， （1.河北农业大学园艺学院， 保定 071001； 南京 210095）摘要：参照拟南芥 利用 RT­PCR及 RACE技术克隆了白菜 WRKY转录因子基因保守序列设计引物， 转录因子基因 cDNA 全长

2、， 命名为(GenBank登录号为 AY836002)。序列白菜 分析发现， 与拟南芥 基因核苷酸序列长 980bp， 推导的氨基酸序列编码 285 个氨基酸残基， 氨基酸序列的同源性为 74%， 与拟南芥接种后 612h， 白菜同源性为59%； 与其它植物WRKY基因的同源性则较低。Southernblot 显示该 基因的表达量最高。用2mmol/L的水杨酸处理后 28h， 基因在白菜基因组中为单拷贝。半定量 RT­PCR分析表明， 以及用霜霉病菌水杨酸； RACE； 关键词： 白菜； 转录因子； 半定量RT­PCR   文章编号： 

3、;S188 A 1006­1304(2007)05­0810­06 中图分类号：文献标识码：CloningandCharacterizationofAFull­lengthcDNAofWRKYTranscriptionFactor Genein 1 2 1 WANGYan­hua ,HOUXi­lin *,SHENShu­xing PCRprimersweredesignedbasedontheconserveddo

4、mainof full­lengthcDNAofWRKYtranscriptionfactorwasclonedfrom cationcDNAend(RACE)techniques.Sequenceanalysisindicatedthat dentitywas74%and59%to genomerespectively. transcriptionfactorsalicylicacidRACEsemi­quantitativeRT­PCR and genesof WRKYtransc

5、riptionfactor.The usingRT­PCRandrapidamplifi­ gene(GenBankaccessionnumber:AY836002) respectively.Thededucedaminoacidsequenceof wasac­ consistedof980nucleotides(nt),anddeducedaminoacidsequencecontaining285aminoacids.Furthercomparisonshowedthatitsi­ ge

6、nehaslowerhomologywithotherplantWRKYgenes.Southernblottinganalysisindicatedtherewasasinglecopyin Semi­quantitativeRT­PCRdemonstratedthatthecorrespondingmRNAof cumulatedmostabundantly28haftertreatmentupon2mmol/Lsalicylicacid,and612hafterinfectionby WRKY 转录因子是一类在植物中起特异作用 的转录调控

7、因子，其名称来源于其蛋白含有高度保守的 60 个氨基酸组成的 WRKY 结构域 （郝中娜和 这类 2006）陶荣祥， 。 自上个世纪九十年代中期以来，烟草、 大麦、 水 基因已在甘薯、 野燕麦、 欧芹、 拟南芥、 稻、 棉花等植物中被克隆(Chen 2003Zhang ,2004Xu 心序列为(T)TGAC 的 W 盒结合， 激活下游基因的2000 表达， 从而开启植物的防卫体系(Eulgem Yu 2001Chen 2002)。WRKY 转录因子 还影响植物的衰老、 抗胁 除参与植物的抗病反应外，, 迫能力、 生

8、长和发育及信号传导过程2000Sun 2004)。研究2004Li 2004Xu ,2006)。WRKY 基因在植物体内并非组成型表达，而是受外界环境的激发 而诱导表达。生物胁迫如病原物及其诱发因子(Yo­WRKY 转录因子通过与抗病基因启动子中核 表明，*基金项目： 高等学校博士点科研基金（No.20030307021） 资助。*通讯作者。Authorforcorrespondence.博士， <hxl>. 教授， 主要从事蔬菜遗传育种与生物技术研究。E­mail： 2007­01­30 接受日期： 2007&

9、#173;04­04 收稿日期：第 5期 王彦华等: 白菜WRKY转录因子cDNA全长的克隆及分析811da 2002Kalde 2003Wang 2005)、 用 Trizol(MDBio)试剂法。 防卫反应信号分子如水杨酸及其功能类似物(Dong 、 环境胁迫如低温、 高温、 高盐和创伤(仇 玉萍等，2004)均能诱导 WRKY基因的表达。 这些结 果表明，WRKY 基因编码的转录调节蛋白具有多种 生理功能，在植物的发育调节和防卫反应中起重要 作用。白菜)霜霉病 是由专性寄生菌Pers.Fr） 引起的一种真菌病害，选用抗病品种是解决这一病害

10、 的最有效途径。 近年来， 植物抗真菌病害基因工程研 究日益受到重视，而目的基因的克隆是转基因育种的基础与关键。本研究以水杨酸 （SA） 处理后的白菜 为实验材料，在已获得的 WRKY 基因 cDNA 片段的基础上 （王彦华等， 2005）， 采用 RACE(rapidam­ plificationcDNAend)技术，获得了白菜 WRKY转录 因子 cDNA 全长序列， 并对该基因的拷贝数及诱导 表达规律进行了分析，为白菜抗霜霉病机制的深入 研究提供基础资料，并为白菜抗病基因工程提供了 基因资源。1 材料和方法1.1 材料供试材料为苏州青白菜ssp. 抗病自交系

11、， 由南京农业大学白菜课题组提供。大肠杆菌)菌株 JM109 由本实验室保存； 质粒载体 pMD18­TDNA聚合酶、限制性内切酶、RNaseFreeDNase玉、 AgaroseGel DNAPurificationKit、 AMV 反转录试剂盒等均购自 TaKaRa 公司； DigDNALabelingandDetectionKit 购自 Roche 公司。 1.2 植物材料的准备将白菜种子播种于装有灭菌基质的穴盘中， 人 工气候箱中按照光照 12h、黑暗 12h 光周期， 2025下培养。幼苗两片真叶时，用 2mmol/LSA KOH 调节 pH 至 6.5） 进行喷

12、雾处理， 处理后分别于 0、2、 4、 8 和 12h 提取叶片总 RNA。 1.3 接种液制备及接种方法参照程永安和何桂兰 （1995） 的方法，对单株采 用喷雾接种， 接种后在 20黑暗中保湿 24h 后， 揭 掉遮光物， 在 2025、 相对湿度 85% ± 5%培养，分别于接种后 0、4、 6、 12、 24 和 48h 提取叶片总 RNA。 1.4DNA 和 RNA 的提取 DNA 的提取采用 CTAB 法，总 RNA 的提取采 1.5RT­PCR利用 RNaseFreeDNase玉去除总 RNA 中痕量DNA 污染， RT 反应参照

13、大连 TaKaRa 生物公司的 TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver.2.1 试剂盒说明 书进行。根据已获得的白菜 部分 cDNA 的序列 （王彦华等， 2005） 设计专一反向引物 W­4， 以拟 南芥cDNA5' 保守氨基酸设计正向简并引物 W­5。在 20 滋L  的反应体系中加入上述 RT 反应液 2 滋L ，正反向引物 W­5 和 W­4 （皆 10 pmol/滋L ） 各 2 滋L ， 另有 1伊PCR Buffer， 200 滋mol/L  d

14、NTP， 2.0mmol/LMgCl2， 1U DNA 聚合酶。 PCR 反应程序： 94变性 1min 后， 94 30s， 56 1 min， 72 2min30s，循环 35 次， 72 10min； 4 保存。 1.63'RACE参考 Li2002） 的方法， 根据已获得的白菜 WRKY 转录因子 cDNA 片段，设计一条正向引物 W­3，通用引物 M4 为反向引物，退火温度为53， PCR 反应体系同上。 1.75'RACE参考李秋莉等 （2001） 的方法， 根据已获得的白 菜 部分 cDNA 的

15、序列 （表 1）， 在靠近 3' 端一侧，设计一条 5' 末端磷酸化反转录引物 SRT­P。 在远离 3' 端，设计两条反向嵌套 PCR 引物 W­6 和W­7；在 SRT­P 近端, 设计两条正向嵌套 PCR 引物 W­8 和 W­3。 第 1轮 PCR 以 cDNA环化反应液为模 板， 正反向引物为 W­8 和 W­6， 退火温度为 50。表1白菜基因克隆引物 Table1Primersforcloning cDNAfrom 引物名称 引物序列 （5'

16、;3'） 序列长度/bp Primer Primersequence Sequence name length W­2 TGGAGRAARTAYGGNCARAAR 21W18­F GCTCCATTAACCTCCCAGAT 20W­3 CGAAAGACTCAAAGTTCACAG 21W­4 TGCGTCCCTTCGTATGTAGC 20W­5 GCMWSWGARYTSCGNGAGGAGCT&

17、#160;23W­6 TCTCCCAGACTGCTGCTAACA 21W­7 AGCTCCTCTCGTAACTCACTT 21W­8 GGATCAAGCACTGTGACTTTG 21SRT­P(P)ATAGCAGCCGCAA 13 N=A/G/C/T,R=A/G,Y=C/T,S=G/C,W=A/T,M=A/C（用812农 业 生 物 技 术 学 报 2007 年第 2 轮 PCR 除正反向引物为 W­3 和 W­7，退火温 度为 54。1.8 目的片段的回收及克隆片

18、段回收按照 TaKaRa 回收试剂盒的使用说明 进行。回收的 DNA 片段连接到 pMD18­T 载体 （TaKaRa） 上。连接产物转化感受态大肠杆菌用上述特异 JM109， 蓝白斑筛选。煮沸法提取质粒， 隆的片段为白菜 基因的 3' 末端。5'RACE进行嵌套式 PCR 扩增，第 1 轮扩增未获得单一条 带，第 2 轮扩增得到了长度为 195bp 的单一条带5' 端为 SRT­P 引物到 W­7 引物间的一段反 （图 3），3' 端与 向序列， 已知序列的 5' 端有 23bp 的重叠区，说明克隆的片段为白菜 端序列。基

19、因 5'引物在相同条件下进行 PCR 扩增， 琼脂糖凝胶电泳 检测插入片段的大小。 1.9Southern 杂交用限制性内切酶玉芋和 玉完全消化 20 滋g  基因组 DNA（37 过夜）， 0.8%琼脂 糖凝胶电泳 12h（ 1V/cm）， 使酶切产物充分分开， 利 用碱性转移液进行转膜。探针的标记、杂交、 洗膜及 显色处理均按照 DigDNALabelingandDetection Kit(Roche)说明进行。1.10 半定量 RT­PCR 分析方法选取保守的延伸因子 作为内标基因 (王彦华等，2006)，分别将 SA处理后 012h 及霜霉病 接种

20、后 048h 的叶片总 RNA 进行反转录反应；通 过调整模板浓度，使 的 PCR 扩增产物量一 致；最后以内标基因 的引物和重新设计的白菜基因片段的引物（预期片段长度为640bp） 进行双重 PCR 分析。PCR 扩增程序为： 94 预变性 5min；94 30s， 58 40s， 72 1min， 29 个循环；72延伸 10min。 1.11 序列测定及分析序列测定由上海博亚生物技术公司在 ABI377测序仪上进行；相似性比较在 NCBI 站点上用 BLAST 完成； 开放阅读框 （ORF） 在 NCBI 站点上用ORFfinder 进行分析；利用 SMAR

21、T 分析推导蛋白 的结构域，利用 ExPASy(expertproteinanalysis system)分析推导蛋白的分子量及等电点。2 结果和分析2.1基因 cDNA 全长的克隆根据拟南芥靠近 5' 端的保守氨基酸设计正向简并引物 W­5， 以获得的白菜的cDNA特异序列设计专一反向引物 W­4，进行 PCR 扩增， 得到了长度为 550bp 的扩增产物 （图 1）。 将该 片段与原先获得的白菜基因 cDNA 片段进行拼接，得到了长度为 724bp 的 cDNA 片段。 3'RACE­PCR 扩增获得了一条 201bp 的条带（图 2

22、），与 RT­PCR 获得的 片段具有 58bp 的 重叠区，并且包含 15bp 的 poly(A)结构， 表明所克 图 1.RT­PCR扩增结果 Fig.1.TheresultofRT­PCR M,markerDL­20001,PCRproductsusingprimerW­4andW­5.图 2.3'RACE扩增结果 Fig.2.Theresultof3'RACE M,markerDL­20001,PCRproductsof3'RACE usingprimerW

23、73;3andM­4.图3.5'RACE扩增结果 Fig.3.PCRproductsof5'RACE M,markerDL­20001,thefirstPCRamplification2,thesecondPCR amplificationproducts.根据上述 PCR 及 RACE的扩增结果，进一步第 5期 王彦华等: 白菜WRKY转录因子cDNA全长的克隆及分析813根据 5'和 3'序列， 设计特异引物: W1­F:5'­GAACTTTTTGTAATGGACTGTTCT

24、73;3' W1­R:5'­CGCTTTTACTCCATTTTAGAGGAA­3'。进行全长 cDNA的扩增，最终获得了 980bp 的 白菜 基因 cDNA 全长序列 （图 4）， 命名为。在 NCBI 站点上用 ORFfinder 分析的开放阅读框 （ORF）， 表明该基因的 5'端含有 12bp 的前导序列区，13870bp 构成一个完 整的开放阅读框架，编码 285 个氨基酸残基的蛋白 质 ， 含有 WRKY 转录因子的保守结构域 WRKYGQK； 然后是 110bp的 3'端尾随序列区 。 将 该序列提交

25、 GenBank， 登录号为 AY836002。图4.基因 cDNA全长的扩增Fig.4.PCRamplificationofthefull­length cDNAof gene M,markerDL­20001,PCRproductsusingprimerW­4andW­5 2.2基因的序列分析用 BLAST 在 GenBank 上对进行同源性检索发现， 其核苷酸序列与拟南芥 的同源性为 89%，与拟南芥 的同源性为84%， 与其它植物的 WRKY 转录因子仅在小的片段 区域存在同源性。推导氨基酸序列的 BLAS

26、T 分析 结果发现，克隆的白菜 基因与拟南芥的同源性为最高， 但也只有 74%， 与拟南芥的同源性为 59%，与拟南芥其它的WRKY 基因的同源性在 30%46%之间。而与其它 植物 WRKY 基因如伤诱导的烟草 WRKY 转录因 子基因 的同源性为 40%，与水稻的一个可能 的 WRKY 蛋白的同源性也是 40%； 与一个 TMV 诱 导的烟草应答基因的同源性则为 48%。 2.3基因的蛋白结构特征分析利用 SMART 进行基因结构分析发现，白菜基因的 N 端由 3565 位氨基酸组成的CC(coiledcoils)模体， CC 模体在蛋白质互作中起重 要作用；160220 位氨基酸为一个典

27、型的 WRKY 结 构域，148218位氨基酸为一个富含半胱氨酸 （C） 和 组氨酸 （H） 的 C 2H  2 型的锌指结构，因此， 应该属于 WRKY域类。利用 ExPASy(expertproteinanalysissystem)分 析白菜 基因，推导的蛋白分子量为 31.75kD， 等电点 （pI） 为 7.34， 表明该蛋白为一中性 蛋白。 2.4基因的拷贝数验证以苏州青白菜的基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增，得到了大小为 447bp 的、含有内含子的基因片段。将该片段回收纯化， 并进行探 针的标记。选取在基因中无酶切位点的玉芋和含有 1 个酶切

28、位点的 玉分别对白菜基因组 DNA进行酶切，按照方法中所描 述的 Southern 杂交程序进行杂交分析。如果玉和 芋酶切产 物应出现 1 玉酶切产物应出现 2条杂交带。酶切及杂交结果见图 5， 从图中可以看出玉和 芋酶切产物均出现了 1 条较强的主带，而玉酶切产物出现了 1 条强带和 1 条弱带，说明 基因在白菜基因组中为单拷 贝。图 5.基因Southernblot 结果Fig.5.Southernblottingresultof 13,Suzhouqingdigestedwith 玉, 芋and 玉,respectively. 2.5SA

29、 处理对基因表达的影响以 SA 处理后 0、 2、 4、 8 和 12h 叶片为材料， 以 内标基因的引物和基因片段的引物进行了双重 PCR 扩增。从图 6 中可以看出，SA 处理白菜后 28h 内其 mRNA 的积累一直维持较 高水平， 之后其表达明显减弱，处理后 12h 的表达 量只有 8h 的 1/3 左右。说明 SA 处理快速诱导了基因的表达。2.6 霜霉病菌接种处理对 基因表达的影响 814农 业 生 物 技 术 学 报 2007 年4、 6、 12、 24、 48 和 72h 利用霜霉病菌接种后 0、 叶片为材料 ， 以内标基因的引物和基因片段的引物进行了双重 PCR 扩

30、增。h 一直保持着较高的表达水平(Yu 2003)。烟草的和2001Dong 亦受 SA2mmol/LSA 处理后 30min 其 mRNA 的快速诱导，从图 7 中可以看出，霜霉病菌接种后 4h 内其mRNA开始积累， 接种后 6h 达到高峰， 直至接种后 12 和 24h 后其表达明显减弱，直至接种后 72h 一 直维持低水平表达。图 6.SA处理后不同时间 基因的表达 Fig.6.Timecourseanalysisof geneexpressionupon treatmentwithSA M,markerDL2000.图 7.接种霜霉病

31、菌后不同时间 基因的表达 Fig.7.Timecourseanalysisof geneexpressionupon inoculationwith M,markerDL2000. 3 讨论在拟南芥 WRKY域中等均受 SA 的快速诱导，2mmol/LSA 处理后 24h 其 mRNA 积累 均达到高峰。特别是 ， 在处理后 1h其 mRNA即有明显的积累，直至处理后 8 参 考 文 献 ChenCHandChenZX.Isolationandcharacterizationoftwo 开始积累， 2h 即达到高峰(Chen

32、 ,2000)。 本实验中，以 2mmol/LSA 处理白菜后 28h 内其 mRNA 的积累一直保持较高的水平，之后其表达明显减弱， 处理后 12h 的表达量只有 8h 的 1/3 左右。说明在 白菜基因同样受 SA 的快速诱导。在拟南芥 WRKY芋中， 用霜霉病菌接种抗病生态型 Columbia（ Col­0） 和均受到不同程度的诱导，但是诱导速度延迟于 SA 和 在接种 4h 后，其 mRNA 积累达到高 峰 ； 和 在接种后 6h，其 mRNA 和则分别在接种后 24h和 48h达到积累高峰。这些基因的诱导表达 模式反映了它们参与不同保护信号转导途径中的抗 病反应(

33、Kalde 2003)。 在拟南芥 WRKY域中，在 用番茄细菌性溃疡病菌接种后 24h 和其mRNA 表达量迅速增加， 和 在接种后 4h 其 mRNA和在接种后 8h 表达量最高， 而 和在接种后 2h 其 mRNA积累即达到了高峰。但 是只有 和 在接种后 24h 尚维持高 和 在接种后 24h 已经检测不到其表达(Dong 2003)。水稻的 基因受非亲和稻瘟病菌的快速诱导，接种后 3h 其mRNA即有明显的积累， 接种后 12h 积累达到高峰(Wang 2005)。在本实验中， 用霜霉病菌接种苏州青白菜抗病自交系 4h 基因开始表达， 6h 后其 mRN

34、A积累达到高峰， 一直维持至接 种后 12h， 其诱导速度明显延迟于 SA处理。这与拟 南芥 WRKY芋中的 和 在接种霜霉 病菌后及 WRKY域中和在接种番茄细 菌性溃疡病菌后的的表达情况类似。按照 Kalde (2003) 划分的基因表达模式， 26h 内 mRNA 积 累迅速达到高峰的属于早期应答基因，说明白菜基因的表达属于对霜霉病菌早期应答的基因，在抗霜霉病的信号转导中具有重要的作用。pathogen­andsalicylicacid­inducedgenesencodingWRKY DNA­bindngproteinsfromtoba

35、cco(J). 2000,42:387396 第 5期 王彦华等: 白菜WRKY转录因子cDNA全长的克隆及分析815ChenCHandChenZX.Potentiationofdevelopmentally regulatedplantdefenseresponseby a pathogen­induced transcriptionfactor(J). 2002,129:706716 ChengYA（程永安） andKeGL(柯桂兰).Factorsaffecting evaluationo

36、fChinesecabbageresistancetodownymildew (J). (西北农业学报),1995,4(4):6972(inChinesewithEnglishabstract) DongJX,ChenCHandChenZX.Expressionprofilesofthe genesuperfamilyduringplantdefense response(J). 2003,51:2137 EulgemT,RushtonPJ,RobatzekSandSomssichIE.The WRKYsuperf

37、amilyofplanttranscriptionfactors(J). HaoZN（郝中娜） andTaoRX(陶荣祥).StudyofWRKY transcriptionfactorsuperfamily(J). (生命科学),2006,18(2):175179(inChinesewith Englishabstract) KaldeM,BarthM,SomssichIEandLippokB.Membersofthe WRKYgroup 芋 transcriptionfactorsarepartof diffe

38、rentplantdefensesignalingpathways(J). 2003,16:295305 Lagace'MandMattonDP.CharacterizationofaWRKY transcriptionfactorexpressedinlatetorpedo­stageembryos of 2004,219:185189 LiJ,BraderGandPalvaET.TheWRKY70transcription factor:Anodeofconvergenceforjasmonate

39、73;mediatedand salicylate­mediated signalsinplantdefense(J). 2004,16:319331 LiQL,GaoXR,YuanXD,LiuDWandAnLJ.Rapid amplificationof3'cDNAendofSuaedaliaotungensisbetaine aldehydedehydrogenaseusingone­stepPCR(J). 2002， 24（ 2）：179181 LiQL(李秋莉),GaoXR(高晓

40、蓉),FanQ(范琦),YuanXD(袁晓东),LiuDW(刘大伟)andAnLJ(安利佳).Rapid amplificationof5'cDNAendof betaine aldehydedehydrogenasebyinversenestedPCR(J). (高技术通讯),2001,11:1719(in ChinesewithEnglishabstract) QiuYP(仇玉萍),JingSJ(荆邵娟),FuJ(付坚),LiL(李璐)and YuDQ(余迪求).Cloningandanalysisofexpre

41、ssionprofile of13WRKYgenesinrice(J). 科学通报),2004,49:18601869(inChinese) SunCX,PalmqvistS,OlssonH,VorenM,AhlandsbergSand JanssonC.AnovelWRKYtranscriptionfactor, , participatesinsugarsignalinginbarleybybindingtothe sugar­responsiveelementsoftheisolpromoter(J). 2003,15:2076­2092 WangHH,XieK,WuKLandGuoZJ.Isolationofarice WRKYgene whoseexpressionisinducedby (J). 2005,32:937946 WangYH(王彦华),HouXL(侯喜林)andShiGJ(史公军). Cloni