蛋白质测定实验报告

1、精品文档蛋白质测定方法化学报告蛋白质的检测附表 蛋白质测定方法的比较方法灵敏度时间原理干扰物质说明凯氏定氮法灵敏度低,适用于费时，8将蛋白氮转化为氨，非蛋白氮（可用三用于标准蛋白质含（净;曲hl法）0.2-1.OmgM, 10ho用酸吸收后滴定,氯乙酸沉淀蛋白质量的准确测定；干误差为坦口而分离），犹少；费时太长口双缩胭法灵敏度低，中速,20多肽键+碱性Cu"硫酸钱；T*缓冲用于快速测定，但Biuret 法20111gSOniinc-紫色络合物。液;某些氨基酸不太灵敏；不同蛋白质显色相似.紫外吸收法较为灵敏，50快速，5蛋白质中的酪氨酸各种嚓吟和唯呢：用于层析柱流出液 lOOMglOm

2、in. 和色氨酸残基在各种核甘酸。的检测；核酸的吸280mn处的光吸收0收可以校正考马斯亮蓝法灵敏度最高,1快速，5考马斯克蓝染料与强碱性缓冲液;Trr最好的方法；干扰(Eradbrd 法)5电15而联 蛋白质结合时，其ionX- 100;SDS物质少;颜色稳定；入皿由465nm变为颜色深浅随蛋白质595nm,不同而变化口酚试剂法灵敏度较局费时蛋白质在碱性溶酚类、柠檬液中其肽键与酸、硫酸镂、20250mgCu2+螯合，形成tris缓冲液、蛋白质一铜复合甘氨酸：糖 物，此复合物使,等均 酚试剂的磷钳酸巧十扰作用还原，产生蓝色化合物由上表可大致了解五种检测蛋白质的方法，下 面以实验的形式进行详细阐

3、述：1材料与方法1.1 仪器材料(1)仪器：凯氏定氮仪、紫外分光光度计、可见光分光光度计、工作离心机、布氏漏 斗、抽滤泵。(2)试剂及原材料：牛奶、酸奶、豆浆、0.12mol/LpH=4. 7 醋酸-醋酸钠缓冲液、乙醇- 乙醴等体积混合液、浓 H2SO4、40%(氧化钠、30%±氧化氢、2%1酸溶液、0.050molPL标准盐酸溶液、硫酸钾-硫酸铜接触剂、混合指示剂、标准蛋白溶液、双缩 胭试剂、考马斯亮蓝 G- 250试剂。1.2 实验方法(1)凯氏定氮法测定蛋白质含量将待测样品与浓硫酸共热，含氮有机物即分解产生氨(消化)，氨又与硫酸作用，变成硫 酸镂。为了加速消化，可以加入CuSO

4、4作催化剂和加入K2SO4以提高溶液的沸点，而加 入30%t氧化氢有利于消化溶液的澄清。消化好的样品在凯氏定氮仪内经强碱碱化使之 分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至定量硼酸溶液中，然后用标准盐酸溶液进行滴定，记录，计 算出样品含氮量。每个样品做三次重复测定，取平均值。(2)紫外吸收法测定蛋白质含量蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共辗双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质，吸收峰在280nm处，其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此 外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。紫外吸收法

5、简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度的盐，例如，生化制备中常用的(NH4)2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定，特别适用于柱层析洗脱液 的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质较多，在用标准曲线法测 定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质有一定的 误差,故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嗯吟、 喀咤及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不

6、相 同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因 pH的改变而有变化，因此要注 意溶液的pH值，测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。取待测样品制成蛋 白浓度大约在0.11.0mgPmL的蛋白质溶液，用紫外分光光度计进行比色，对照标准 曲线得出样品含氮量。每个样品做3次重复测定，取平均值。(3)双缩月尿法测定蛋白质含量双缩胭（NH3CONHCONHB沏个分子胭经180 c左右加热,放出一个分子氨后得到的产 物。在强碱性溶液中，双缩胭与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩胭反应。凡具有两个 酰胺基或两个直接连接的肽键，或能够以一个中间

7、碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩胭反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。此法的优点是测定较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少；主要的缺点是灵敏度差。因此双缩胭法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。取待测样品制成蛋白浓度大约在 110mgPmL勺蛋白质溶液，加双缩胭试剂染色30min, 用可见光分光光度计进行比色，对照标准曲线得出样品蛋白质含量。每个样品做3次重复测定，取平均值。（4）考马斯亮蓝法测定蛋白质含量由于双缩月尿法（Biuret 法）存在明显的缺点和许多限制，因此1976年由Bradfo

8、rd建立 的考马斯亮蓝法（Bradford法），这是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋 白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。Bradford法的突出优点是：a.灵敏度高。据估计，比Lowry法约高4倍，其最低蛋白质检测量可达 1mg这是因为蛋 白质与染料结合后产生的颜色变化很大 ，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因而 光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大得多。b.测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定 ，只需要5min左右。由于染 料与蛋白质结合的过程，大约只要2min即可完成，其颜色可以在1

9、h内保持稳定，且在520min之间，颜色的稳定性最好，因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时 间。c.干扰物质少。如干扰Lowry法的K'、Na 离子、丁讴 缓冲液、糖和蔗糖、甘油、琉基乙醇、EDTA均不干扰此测定法。此法的缺点是：a.由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同 ，因此Bradford法用于不同 蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线日t通常选用丫 -球蛋白为标准蛋白质，以 减少这方面的偏差。b.仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、TritonX- 100 、十二烷 基 硫酸钠（SDS）和0. 1N的NaOH （如同0. 1N的酸干扰

10、Lowry法一样）。c.标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测 定未知蛋白质的浓度。】取待测样品加入考马斯亮蓝G- 250试剂放置5min后,用可见光分光光度计比色,对照标准曲线得出样品蛋白质含量。每个样品做3次重复测定，取平均值。2结果与分析2.1 实验结果表1样品蛋白质含量的测定结果牛奶酸奶豆浆凯氏定氮法3.092. 130.81紫外吸收法-2.88双缩胭法3. 162, 160.91考马斯亮蓝法3. II2. 180.862.2 实验结果分析(1)凯氏定氮法可测出全部 3种样品的蛋白含量，测试结果准确，只是蒸储与吸收装置复杂,不便于操作，实验过程所

11、需时间较长，操作复杂。(2)紫外吸收法无法测出牛奶、酸奶的蛋白含量，测出的豆浆蛋白含量也与实际值相差较大，不具实际使用价值。此方法实验过程简单，适用于测试无色样品，对于有色样品需进行预处理，排除颜色干扰后才适用于此方法。(3)双缩胭法适用于被测的 3种样品，实验操作简便迅速，但其缺点是灵敏度较低，蛋白 质量须在120mgPmL寸测定结果较准确。因此实验前要估测被测样品的蛋白含量 ，把 样品稀释至蛋白浓度为120mgpm L(4)考马斯亮蓝染色法可以测出被测的全部 3种样品，此方法快速、灵敏，但只有作微量 蛋白测定时的结果才准确，因此在实验前应将样品稀释至蛋白浓度为 0.11mgPmL而 且实验

12、必须在1h内完成，不然测试结果不准确。(5)酚试剂法原理：蛋白质在碱性溶液中其肽键与 CiT螯合，形成蛋白质一铜复合 物，此复合物使酚试剂的磷铝酸还原，产生蓝色化合物，在一定条 件下，利用蓝色深浅与蛋白质浓度的线性关系作标准曲线并测定样 品中蛋白质的浓度。优点：操作简便，灵敏度高，比双缩月尿法灵敏得多，样品中蛋白质含 量高于5g即可测得，是测定蛋白质含量应用得最广泛的方法之 一。缺点：费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直 线形式，且专一性较差，干扰物质较多。对双缩月尿反应发生干扰的离子，同样容易干扰lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸镂、tris缓冲

13、液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素（0.5%）,硫酸纳（1% ,硝酸纳（1% ,三氯乙酸（0.5%）,乙 醇（5% ,乙醍（5% ,丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这 些物质浓度高时，必须作校正曲线。含硫酸镂的溶液，只须加浓碳 酸钠一氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会 色浅，则必须提高碳酸钠一氢氧化钠溶液的浓度12倍。适用范围：适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。此法可检测的最低蛋白质 量达5mg通常测定范围是20250mg个人想法一一蛋白质是我们生活中不可或缺的东西，无论是各种乳制品还是 一些保健产品，蛋白质的含量无疑是一个受人瞩目的指标。然而，纵观我们现在使用的这些蛋白质检测方法，很明显 的都有一个“不适合大规模检测”的特点，这对于现在的大规 模生产模式显然不适用。而且，更为严重的是，所有的检测方 法都会受到许多其它物质的干扰作用，之前闹得沸沸扬扬的三 鹿奶粉事件就是利用了凯式定氮法中的检测漏洞（检测时检测 的是氮元素的含量，那么，一些非来自于蛋白质的氮就会被当 成蛋白质中的，从而“提高” 了蛋白质的含量检测结果）所以，不管怎么样，在蛋白质的检测中