膳食纤维的测定

1、粗纤维”一词最早用于营养学研究，并被认为是对人体不起营养作用的一种非营养成分。然而近年来分析技术的发展和对这种非营养素”认识的提高，粗纤维”也被 膳食纤维”所替代，而且赋予更丰富的内容。膳食纤维大致分为二类，一类为可溶性的，一 类为不可溶性的，二者合并即为总的膳食纤维。它主要包括植物细胞壁的成分如纤维素、 半纤维素、果胶、木质素、角质和二氧化硅等成分，最早曾有中型洗涤剂法和酸性洗涤 剂法等，测定结果常不能包括全部。本章所介绍的Englist建立的、AOAC推荐的方法。它主要测定为可溶性的膳食纤维、不可溶性膳食纤维和总膳食纤维三种。膳食纤维实际上属于碳水化合物的范畴。膳食纤维的物化特性主要包括

2、5个方面：（1）很高的持水力。（2）对阳离子有结合和交换能力。（3）对有机化合物有吸附螯合作用。（4）具有类似填充剂的充盈作用。（5）可改变肠道系统中的微生物群系组成。膳食纤维的测定方法主要有三种，包括非酶-重量法、酶重量法和酶化学法。非酶重量法是一个比较古老的方法，只能用于粗纤维的测定。 而中性洗涤剂法也只能测定不溶性的膳食纤维。酶重量法却可以测定总膳食纤维（包括可溶和不可溶性膳食纤维），也是AOAC的标准方法。酶化学法是 AOAC最新承认的另一个标准方法，但此法易受仪 器条件的限制，不适用于普通实验室。目前国标采用的还是中性洗涤剂法，食物成分表 中列出的数据都是不溶性膳食纤维，所以下文先介

3、绍不溶性膳食纤维的测定方法。（一）中性洗涤剂法1. 原理在中性洗涤剂的消化作用下， 样品中的糖、淀粉、蛋白质、果胶等物质被溶解除去，不能消化的残渣为不溶性膳食纤维，主要包括纤维素、半纤维素、木质素、角质和二氧 化硅等，并包括不溶性灰分。2. 适用范围GB 1239490适用于各类植物性食物和含有植物性食物的混合食物中不溶性膳食 纤维的测定。3仪器（1）烘箱：110 130C。(2) 恒温箱：(372 C。(3) 纤维测定仪。(4) 如没有纤维测定仪，可由下列部件组成：电热板：带控温装置。高型无嘴烧杯：600mL。玻料坩埚：容量 50mL,孔径4060“。回流冷凝装置。抽滤装置：由抽滤瓶、抽滤垫

4、及水泵组成。4试剂实验用水均为蒸馏水，试剂不加说明均为分析纯试剂。(1) 无水亚硫酸钠。(2) 石油醚：沸程 3060 C。(3) 丙酮。(4) 甲苯。(5) 中性洗涤剂溶液：将 18.61gEDTA二钠盐和6.81g +水合四硼酸钠置于烧杯中，加水约150mL,加热使之溶解，将30g月桂基硫酸钠和10mL乙二醇独乙醚溶于约 700mL 热水中，合并上述两液，再将 4.56g无水磷酸氢二钠溶于150mL热水中，再并入上述溶 液中，用磷酸调节上述混合液至pH6.97.1，最后加水至1000mL。(6) 磷酸盐缓冲液：由38.7mL 0.1mol/L磷酸氢二钠和61.3mL 0.1mol/L磷酸二

5、氢钠 混合而成，pH为7。(7) 2.5% a淀粉酶溶液：称取2.5g a淀粉酶(Sigma公司，VI-A型，产品号6880) 溶于100mLpH7的磷酸盐缓冲溶液中，离心，过滤，滤过的酶液备用。(8) 耐热玻璃棉：耐热 130C，美国Corning玻璃厂出品，PYREX牌。5. 操作步骤(1) 样品制备： 粮食：磨粉，过20目筛(1mm),贮于塑料瓶内，盖紧瓶塞保存，备用。 蔬菜及其他植物性食物：取其可食部，用水洗净，纱布吸去水分，打碎，沸合 均匀后备用。 脂肪含量超过10%样品：需先去除脂肪，即样品1.00g，用石油醚提取3次，每次10mL。(2) 取样0.51.0g，力口 100mL中性

6、洗涤剂溶液，再加 0.5g无水硫酸钠。(3) 电炉加热，5min内使其煮沸，移至电热板上，保持微沸1h。(4) 于玻料坩埚中铺1g玻璃棉，移至烘箱中，110 C4h,取出置干燥器中，晾至 室温，万分之一天平称重，得 ml。(5) 将煮沸后样品趁热倒入滤器，用水泵抽滤。用600mL热水(90100C),分 数次洗烧杯及滤器，抽干。洗净滤器下部的液体和泡沫，塞上橡皮塞。(6 )于滤器中加酶液，液面需覆盖纤维，用细针挤压掉其中气泡，加几滴甲苯， 盖上表玻皿，37 C恒温箱中过夜。(7) 取出滤器，除去底部塞子，抽去酶液， 并用300mL热水分数次洗去残留酶液，用碘液检查，如有残留，继续加酶水解，如淀

7、粉已除尽，抽干，再以丙酮洗2次。(8) 将滤器置烘箱中，110C 4h,取出，置干燥器中，晾至室温，精确称重，得m2。6. 计算式中3样品中不溶性膳食纤维的含量，；ml滤器加玻璃棉的质量，g;m2 滤器加玻璃棉及样品中纤维的质量，g;m样品质量，go7. 注意事项(1 )因酶配成溶液后其活力会随时间延长而下降，从而影响酶解效力，所以酶溶 液需当天现配。(2) 过滤时若遇到操作困难，可采取滴加淀粉酶和将样品称重减少至0.3g的方法 来加快过滤。(3) 每次实验用完的坩埚去除玻璃棉，若玻板上残渣较多，可用重铬酸钾洗液浸 泡数小时后取出，用水冲洗干净以备下次实验使用。(二)酶重量法1. 原理样品分别

8、用a淀粉酶、蛋白酶、葡萄糖苷酶进行酶解消化以去除蛋白质和可消化的淀粉。总膳食纤维(TDF)是先酶解，然后用乙醇沉淀，再将沉淀物过滤，将TDF残渣用乙醇和丙酮冲洗，干燥称重。不溶性和可溶性膳食纤维(IDF和SDF是酶解后将IDF过滤，过滤后的残渣用热水冲洗，经干燥后称重。SDF是将上述滤出液用4倍量的95%乙醇沉淀，然后再过滤，干燥，称重。TDF IDF和SDF量通过蛋白质、灰分含量进行校正。2. 适用范围本方法适用于各类植物性食物和保健食品(AOAC991.43)。3仪器(1) 烧杯：400mL或600mL高脚型。(2) 过滤用坩埚：玻料滤板，美国试验和材料学会 (ASTM) 4060 口m,

9、 Pyrex 60mL(Corning No.36060 buchner，或同等的)。如下处理： 在灰化炉525C灰化过夜。炉温降至 130C以下取出坩埚。 用真空装置移出硅藻土和灰质。 室温下用2%清洗溶液浸泡1h。 用水和去离子水冲洗坩埚；然后用15mL丙酮冲洗然后风干。 在干燥的坩埚中加0.5g硅藻土，在130 C烘干恒重。 在干燥器中冷却1h，记录坩埚加硅藻土质量，精确至 0.1mg。(3) 真空装置： 真空泵或抽气机作为控制装置。 1L的厚壁抽滤瓶。 与抽滤瓶相配套的桷皮圈。(4) 振荡水浴箱： 自动控温使温度能保持在(98 2 Co 恒温控制在60 C。(5) 天平：分析级，精确到

10、 土 0.1mg(6) 马福炉：温度控制在(5255 C。(7) 干燥箱：温度控制在 105C和(1303) C。(8) 干燥器：用二氧化硅或同等的干燥剂。干燥剂两周一次在130 C烘干过夜。(9) pH计：注意温控，用pH4.0、7.0和10.0缓冲液标化。(10) 移液管及套头：容量 100 口 L和5mLo(11) 分配器或量筒： (15 0.5 mL,供分配78%的乙醇、95%的乙醇以及丙酮。 (40 0.5 mL，供分配缓冲液。(12) 磁力搅拌器和搅拌棒。4试剂全过程使用去离子水，试剂不加说明均为分析纯度剂。(1) 乙醇溶液： 85 % :力口 895mL95%乙醇在1L量筒中，用

11、水稀释至刻度。 78 % :加821mL95%乙醇在1L量筒中，用水稀释至刻度。(2) 丙酮。(3) 供分析用酶：在 05 C下贮存。 热稳定 a淀粉酶溶液：Cat. No. A3306, Sigma Chemical Co, St.Louis, MO63178, 或 Termamyl 300L, Cat. No. 361 6282, Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark，或等效 的酶。 蛋白酶：Cat. No. P3910, Sigma Chemical Co.或等效的。当天用 MES/TRIS缓冲 液中现配50mg/mL酶溶液。 淀粉葡糖苷酶溶液： Cat. N

12、o. AMG A9913, Sigma Chemical Co,或等效的。(4) 硅藻土：酸洗(Celite 545 AW, No. C8656, Sigma Chemical Co,或等效的)。(5) 洗涤液：两者挑一。 铬酸：120g重铬酸钠Na2Cr2O72H2O, 1000mL蒸馏水和1600mL浓硫酸。 实验室用液体清洁剂，预备急需清洗的( Micro, International Products Corp.,Trenton, NJ08016,或等效的)。用水配制2%溶液。(6) MES- TRIS缓冲液：0.05mol/L，温度在 24 C 时 pH 为 8.2。 MES : 2

13、( N-吗啉代)磺酸基乙烷(No.M 8250, Singma Chemical Co或等效 的)。 TRIS:三羟(羟甲基)氨基甲烷(No.T 1503, Sigma Chemical Co或等效的)。在1.7L的蒸馏水中溶解 19.52gMES和12.2gTRIS用6mol/L NaOH调pH到8.2，用 水定容至2L注意：24C时的pH为8.2，但是，如果缓冲液温度在 20C, pH就为8.3, 如果温度在28C, pH为8.1。为了使温度在2028C之间，需根据温度调整 pH。(7) HCl溶液：0.561mol/L，加 93.5mL 6mol/L 盐酸到 700mL 水中，用水定容

14、1L。5. 操作方法(1) 样品制备： 固体样品：如果样品粒度 0.5mm，研磨后过0.30.5mm (4060目)筛。 咼脂肪样品：如果脂肪含量10%,用石油醚去脂。每克样品用25mL，每次提取完静置一会儿再小心将烧杯倾斜，慢慢将石油醚倒出，共洗3次。 高碳水化合物样品：如果样品干重含糖50%，用85%乙醇去除糖分，每克样 品每次10mL,共洗3次轻轻倒出，然后在40C烘箱中不时翻搅干燥过夜， 并研磨过0.5mm 筛。(2) 样品消化： 准确称取双份(1.000 0.005g样品(ml和m2),置于高脚烧杯中。 在每个烧杯中加入40mL MES TRIS缓冲液，在磁力搅拌器上搅拌直到样品完全

15、分散注意：防止团块形成，使受试物与酶能充分接触。 用热稳定的淀粉酶进行酶解处理：加 100 口 I热稳定的淀粉酶溶液，低速搅拌。 用铝箔片将烧杯盖住，在 95100C水浴中反应 30mi n注意：起始的水浴温度应达到 95C 。 冷却：所有烧杯从水浴中移出，晾至60 C。打开铝箔盖，用刮勺将烧杯边缘的网状物以及烧杯底部的胶状物刮离，以使样品能够完全的酶解。用10mL蒸馏水冲洗烧杯壁和刮勺。 用蛋白酶进行酶解处理：在每个烧杯中各加入10 口蛋白酶溶液。用铝箔盖住，在60C持续摇动反应30min注意：开始时的水浴温度应达 60C ，使之充分反应。 pH测定：30min后，打开铝箔盖，搅拌中加入5m

16、L 0.561mol/L HCI至烧杯中。60C时用溶液或1mol/L HCl溶液调最终pH为4.04.7注意：当溶液为60C时检测和调 整pH,因为在较低温度时pH会偏高。 用淀粉葡糖苷酶溶液酶解处理：搅拌同时加100 口淀粉葡糖苷酶溶液。用铝箔盖住，在60C持续振摇反应30min，温度应恒定在60C。(3) 测定： 总的膳食纤维测定：用乙醇沉淀膳食纤维：在每份样品中，加入预热至60 C的95%乙醇225mL，乙醇与样品的体积比为 4:1。室温下沉淀1h。过滤装置：用15mL78%乙醇将硅藻土湿润和重新分布在已称重的坩埚中。用适度的抽力把坩埚中的硅藻土吸到玻板上。酶解过滤，用78%乙醇和刮勺

17、移所有内容物微粒到坩埚中注意：如果一些样品形成胶质，用刮勺破坏表面，以加速过滤。抽真空，分别用15mL的78%乙醇，95%乙醇和丙酮冲洗残渣各 2次，将坩埚内的 残渣抽干后在105 C烘干过夜。将坩埚置干燥器中冷却至室温。坩埚重量，包括膳食纤 维残渣和硅藻土，精确称至 0.1mg。减去坩埚和硅藻土的干重，计算残渣重。 蛋白质和灰分的测定：取成对的样品中的一份测定蛋白质，用本书前述或GB960.52方法测定。用(NX 6.25作为蛋白质的转换系数)。分析灰分时用平行样的第二份在525C灼烧5h,在干燥器中冷却，精确称至0.1mg,减去坩埚和硅藻土的质量，即为灰分质量。 不溶性膳食纤维测定：称适量样品按 进行酶解，过滤前用 3mL水湿润和重新分布硅藻土在预先处理好的坩埚上，保持抽气使坩埚中的硅藻土抽成均匀的一层。过滤并冲洗烧杯，用10mL70C水洗残渣2次，然后再过滤并用水洗，转移到600mL 高脚烧杯，保留用以测定可溶性膳食纤维，按操作。用抽滤装置，分别用15mL78%乙醇，95%乙醇和丙酮各冲洗残渣 2次。注意：应及时用 78%乙醇、95%乙