肿瘤细胞培养

1、第6章肿瘤细胞得培养肿瘤细胞培养就是研究癌变机理、抗癌药得敏感性、肿瘤细胞与癌分子生物学特性得重要手段.癌细胞就是比拟容易培养得细胞,当前所建立得细胞系中癌细胞就是最多得.应用体外细胞培养技术进行肿瘤研究具有许多优点：(1)可免受机体内环境因素得影响,预防了个体差异性,便于探索各种物理、化与生物因素对肿瘤细胞生命活动得影响.(2)既便于从细胞水平上研究肿瘤细胞得结构与功能,又便于从基因及分子水平上研究癌变得发生机理；(3)可长期传代、保存,便于观察肿瘤细胞生物学特性与遗传行为得改变.(4)可用于快速筛选抗癌药物与研究耐药机理.(5)研究周期短,比拟经济.但就是它也有缺点,如长期培养可使细胞生物

2、学特性发生改变；体外实验所得得结果不能完全代表体内得情况,应与体内试验结合研究更为合理等.一、肿瘤细胞培养得生物学特性1、形态与性状形态不规那么,细胞界限清楚,伸展较差,核膜、核仁轮廉明显,核仁多、核浆丰富、折光性强,电镜观察细胞表而微绒毛多而细密,与肿瘤细胞具不左向运动与铺着不依赖性有关、2、生物特性癌细胞在无血清或低血清(2%5%)时仍能生长,营养要求不奇,因能自分泌促增殖因子,在软琼脂培养时单个细胞能形成集落,生长方向性消失,再加上失去了接触抑制,癌细胞数量增多时可呈多层重叠生长,细胞饱与密度大,有丰富得三极有丝分裂,分裂指数高,细胞倍增周期短.3、永生性永生性也称不死性,在体外培养中表

3、现为可无限制传代而不凋亡(Apoptosis),体外培养得肿瘤细胞系(株)都表现有这种特性.但体外培养得永生性与体内肿瘤得恶性(包括侵润性)就是两种性状,受不同基因调控得,因恶性肿瘤多数在体外培养时并不那么容易获得成功,生长增殖水平并不旺盛,有时只能传假设代,说明体外培养得永生性可在体外培养后获得得.另外,体外培养得许多细胞系,如N1H3T3、Rat-110T1/2等均具有永生性而无恶性.但两者有相关性,永生性可能就是细胞恶性变得某一阶段.4、侵润性侵润性就是肿瘤细胞扩张性增殖行为.体外培养得肿瘤细胞仍保持有这种特性,当与正常组织混合培养时,能侵润入其她正常组织中,甚至能穿透人工隔膜.5、异质

4、性所有肿瘤细胞都就是由增殖水平、遗传性、尼源、周期状态等性状不同得细胞组成,属于异质性,其中有得衰老、退化,有得处于周期阻滞状态,只有那些处于活泼增殖得肿瘤细胞才就是支持肿瘤生长得成分,肿瘤下细胞易于生长增殖,别离培养干细胞得方法称干细胞培养(有干细胞系与数个亚系组成).6、细胞遗传性失去二倍体核型,呈异倍体或多倍体,常有标记染色体出现,正常细胞与恶性肿瘤细胞得区别,如表6-1所示.表6-1区别正常成纤维细胞与恶性肿瘤细胞得常用指标指标正常成纤维细胞恶性肿瘤细胞形态棱形或多角形,伸展良好,折光较弱,核浆比例小,嗜碱性弱,核仁较少较小,多核巨细胞少见多角形或细长形,伸展较差,折光强,核浆比例大,

5、嗜碱性强,核仁多、大,常见多核巨细胞生长特性排列有方向性,单层生长,有接触抑制,饱与密度低方向性消失,多层重叠生长,接触抑制消失？饱与畸高粘附性细胞间粘附性强,紧贴壁生长细胞间粘附性弱,易脱落血清得要求必须有血清无需血清能生长在半固体琼脂中生长水平不能生长能生长,形成集落电子显微镜观察核蛋白体较少,微丝微管有规那么排列核蛋白体丰富,微线微管消失细胞膜对低分子物质通透性粘多糖得合成与分泌腺昔酸环化断活性细胞内CAMP浓度低多高高高少低低对松抱菌素得反响不刺激核分裂,或至多形成双核细胞核持续分裂,形成多核巨细胞致瘤试验不能形成肿瘤能形成肿瘤二、培养肿瘤细胞得生物学特性得检测体外培养得细胞一旦建立细

6、胞系就需要进行一系列得细胞生物学特性鉴定,其目得在于：证实培养得细胞就是否来自原来得肿瘤细胞.说明肿瘤组织类型、描述肿瘤细胞得生物学特性.通常要检查以下项目：1、组织起源应说明培养材料起源于哪个胚层、器官组织、什么样供体、何种疾病等,必要时要提供病理诊断鉴定资料、2、形态观察观察细胞一般形态如细胞形状,核浆比例倒宜,有丰富得三极或多极有丝分裂,核仁清晰、多个,微丝、微管排列紊乱.3、细胞生长特点检测细胞生长曲线,细胞分裂指数,倍增时间及细胞周期、癌细胞失去正常得接触抑制,呈多层生长,生长旺盛,倍增时间缩短,饱与密度大,分裂指数较高,具无限增殖水平,细胞浸润水平较强等.4、软琼脂培养癌细胞在低密

7、度下仍具有高度存活率,并在软琼脂中形成集落、5、细胞核型分析检测核型特点,染色体数量,有无标记染色体,染色体带型等,癌细胞大多为异倍体,多倍体,并有标记染色体、6、动物致瘤试验裸鼠背部皮下接种IX10?2X109/L癌细胞能生长形成实体瘤,K组织学形态与原发瘤相似.7、组织化学检查癌细胞中脱氧核糖核酸、酸性磷酸酶与磷脂增多,碱性磷酸酶下降,乳酸脱氢酶与琥珀酸脱氢酶活性也改变.8、英她生物学特性检测有凝集试验等.三、肿瘤细胞得取材与培养（一）肿瘤细胞得取材方法培养肿瘤细胞得材料一般来自患者,对实体瘤患者可取原发肿瘤组织或转移灶,有胸、腹水患者可取胸水或腹水,白血病患者可取血液或骨髓液进行培养.1

8、、实体瘤取材方法取术后或活检标本,要尽早浸入无血清培养液保鲜,尽快进行培养.尽可能去除溃疡及坏死组织,预防细菌、霉菌污染,对取自外露得肿瘤组织,应在培养前在含二性篷素B2ug/mL清霉素200?1000u/mL,链签素500ug/mL得培养液中浸泡10?20分钟,再用洗液反复冲洗干净后,再作培养、2、体腔液得取材方法在无菌条件下采取体腔液胸水或腹水,不需加抗凝剂,可直接以1200r/min收集细胞,不要久置,也不要在冰中冷却,而应尽早接种、3、血液骨髓取材法白血病患者可取血液或计髓,主要以取外周血为研究对象,用肝素抗凝得注射器无菌抽取5?10mL外周血,置于试管中马上别离培养.（二）肿瘤细胞得

9、培养方法肿瘤细胞对培养基要求不如正常细胞严格,一般常用RPM1640.DMEM.Mc-Coy5A等培养基,血清浓度不高,10%即可,建议在原代培养时最好能参加生长因子或原患者血清1%?2%以利细胞生长,培养方法很多,主要有组织块法、酶消化法、钮网法、脱落细胞法等.原代细胞得培养方法如下：1、组织块培养法将取得得瘤组织去除脂肪结缔组织及坏死局部,在平皿中用Ilanks液洗3次,剪碎组织,切成l2mm3小块,接种于事先涂有鼠屋胶原得培养瓶或皿中,3TC5%或加盖瓶塞在普通恒温箱中培养.2、酶消化法在上述得碎组织块中参加0.25%胰蛋白酶或2000u/ml胶原酶在37水浴中消化30分钟或更长一些,去

10、除消化液,用洗液洗3次,培养液洗1次后,用完全培养基悬浮,并用吸管吹打分散制成细胞悬液,计数.以5XIONOX10几细胞浓度,在含有10%小牛血清得RPMI1640或Eagl亡MEM或DMEM中37C%CO:下分瓶或皿培养.3、钮网培养法在一张面积约为1cm得钮网上放入上述剪碎得一块或几块肿瘤组织块1?2mm彳大小,用银子轻压,使其粘于网上,再把锂网放入培养皿中,使网下得组织块与皿壁紧紧接触,于37C%CO:下培养,每隔2?3天换液一次,5天后可见有上皮细胞从网上移出,并能在相当于肿瘤组织部位形成纯洁得单层上皮细胞.3、脱落细胞法将新鲜得肿瘤组织去除脂肪与结缔组织,洗液洗2次后,用刀片将肿瘤组

11、织切成细薄片,在切割得同时有许多上皮细胞脱落下来,脱落细胞经洗涤后,参加完全培养基便可获得较纯得上层细胞,于培养瓶 或皿 中、375%C0=下培养,每隔2?3天换液,7?10天上皮细胞逐渐长成单层、在原代培养中,常在培养物中混有正常成纤维细胞,假设把正常细胞误认为就是癌细胞,就会使整个工作失去意义,假设不及时去除这些成纤维细胞,由于它比肿瘤细胞生长快,最终能抑制肿瘤细胞得生长、因此,尽早排除成纤维细胞,已成为肿瘤细胞长期培养建系得关键,现已发现有许多因素能抑制成纤维细胞生长见表62.表6-2抑制成纤维细胞生长得因素方法因素组织细胞胚胎小肠、心肌表皮乳癌各种肿瘤转化细胞表皮细胞表皮正常与恶性乳腺

12、上皮结肠癌肾组织乳腺表皮肝细胞三成纤维细胞得排除方法为了在肿瘤细胞中排除成纤维细胞,常采用五种方法,即机械刮除法、反复贴壁法、消化排除法、胶原酶消化法、密度梯度离心法.1、机械刮除法用不锈钢丝末端得橡胶刮头 用胶塞剪成三角形插入不锈钢线 或裹上少许脱脂棉制成,装入试管中高压蒸气灭菌后备用 也可用特制电热烧灼器刮除.程序如下:1标记镜下观察,用记号笔在培养瓶皿得背而圈下肿瘤细胞得部位.2刮除弃掉培养液,把无菌胶刮伸入瓶皿中,在肉眼或显彳镜窥视下,刮除无标记细胞空间Hanks液冲洗1?2次,洗除被刮掉得细胞.4参加培养基继续培养,如仍有成纤维细胞残留,可重复刮除至彻底刮净为止.2、反复贴壁法根据肿

13、瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢得特点,并结合使用不加血清得营养液.把含有两类细胞得细胞悬液反复贴壁,使两类细胞相互别离.方法如下同贴壁传代：1待细胞生长达一泄数疑后,倒去旧液,用0.25%胰蛋白酶消化后.Hanks液洗2次,参加不含血清得培养液吹打分散,制选择性附着选择性附着底物集合饲细胞层选择性培养基胰蛋白酶胶原酶聚丙稀酰胺聚四氟乙烯(Tef1on)屣3TF人胎小肠D?缄氨(Valine)MCDB710MCDB-153Phenobarbitone成单细胞悬液、2取三个培养瓶分别编号为A、B、C,首先把细胞悬液接种入A瓶,置温箱中静置培养520分钟后,轻轻倾斜培养瓶,让液体集中瓶角后,慢慢吸出全

14、部培养物,再接种于B瓶中,然后向A瓶中补充完全培养基卷温箱继续培养.(3)B瓶中得细胞静宜培养520分钟后,按处理A瓶得方法,把B瓶中得培养液与细胞悬液吸出并注入C瓶中,再向B瓶补加完全培养基,C瓶补加少量小牛血清(浓度为10%)、三个瓶一并在培养箱中培养,如操作成功,次日观察,可见A瓶中主要为成纤维细胞.B瓶中两类细胞混杂,C瓶中主要为上皮细胞(癌细胞),必要时可反复处理几次直至癌细胞纯化为止.3、消化排除法此法曾用于乳癌细胞得培养,具体方法如下：(1)先就是用0.25%胰蛋白酶与0.02%EDTA(1:1)混合液漂洗培养细胞一次,然后加入新得混合液继续消化直到有半数细胞开始脱落时,立即停止

15、消化.(2)把消化液离心弃去上清,沉下得细胞用培养基重悬并吸入另一培养瓶中,置温箱培养,向原瓶中补加新得培养基继续培养,此法处理后,鉴于成纤维细胞比肿瘤细胞先脱落,原瓶中留下得多为肿瘤细胞,经过几次反复处理,就能把成纤维细胞除净.4、胶原酶消化法本法就是利用成纤维细胞对胶原较为敏感得特点？通过消化进行选择.(1)可用0.5mg/mL得胶原酶消化处理,边消化边在镜下窥视,当发现成纤维细胞被除掉后即终止消化.(2)用Hanks液洗涤处理一次后,更换新培养基傩续培养,可获纯洁肿瘤细胞,假设未去除净,可再次重复、5、密度梯度离心法用泛影匍胺与聚蔗糖配制成比重1、025?1.085得密度梯度别离液,参加

16、细胞悬液后,25OOr/min离心10分钟,在比重1.025?1.050层为成纤维细胞,在比重为1.065?1.085层为上皮细胞,将收集得上皮细胞经洗液3次后,进行培养可获纯洁得肿瘤细胞.最近,有人用SOD来抑制成纤维细胞得生长,这些方法都需进行预试验取得经验,找出适合条件,才能获得好结果.(四)血癌细胞分!培养1、采血与别离白细胞用肝素抗凝得注射器无菌抽取白血病患者外周血5?1OmL,宜无菌离心管中,斜放于37C得水浴中,待红细胞沉淀后,将血浆局部吸入另一离心管中,以1500r/min离心15分钟,收集细胞,用含20%小牛血清得RPMI1640含50u(ug)/mL青、链霉素培养液调整细胞

17、浓度至IX10细胞/L以上,开始接种浓度要大.培养基中参加患者血涓为1%?2%.2、 原代培养物得维持：将别离得患者白细胞种入链霉素小瓶中,每瓶3mL在37C温箱中进行悬浮状态得静置培养,每隔23天半戢换一次,吸出1.5mL旧液弃去,参加新鲜完全培养基1.5mL.假设换液前培养基中得pH有下降,说明细胞存活,起先一直坚持换液,不分瓶传代,直至细胞有明显增殖再扩大培养、3、传代培养(直到建系)细胞增殖后,pH下降明显时,说明细胞有明显增殖,此时摇动细胞,在细胞悬液中有少量细胞结成得团块,可转入传代培养,开始以1:2分瓶培养,当传至10代左右,细胞开始生长减慢,几乎不分裂,甚至有许多细胞死亡,此时

18、再并瓶培养,坚持每3天换液一次,23周后细胞已适应了外界环境,开始增殖,然后每2天换一次液,每周传一代,即参加等量培养基以1:2分瓶培养,细胞增殖快时以1:3分瓶,即每瓶参加6mL,共汁9mL,分成3瓶,每瓶3mL,继续培养,当传至20代以上时已根本稳左,可以认为已根本建系我院共建了两个白血病细胞系,即S:粒单型白血细胞系与弘急性淋巴细胞白血病细胞系.(五)提升肿瘤细胞培养存活率与生长率得举措根据人们得经验.肿瘤细胞在体外不易培养健立能够传代得细胞系更为困难,当肿瘤组织或细胞初代培养后,常出现以下几种情况：(1)完全无细胞游出或移动.(2)有细胞移动与游出,但无细胞增殖,细胞长时间处于停滞状态

19、以致难以传代.(3)传数代后细胞增殖缓慢,经过一段停滞期后,才呈现旺盛生长状态,形成稳泄生长得肿瘤传代细胞系、以上说明：肿瘤细胞原代培养时对体外生存条件有较高要求,并需经对新环境适应才能生长,因此不能局限于一般培养法,必须采取特殊得举措.1、适宜底物把纯化得细胞接种在不同得底物上,如鼠尾胶原底层或饲养细胞层等.2、生长因子将促进细胞生长因子参加培养基中进行细胞培养,常用胰岛素、氢化可得松、雌激素以及其她生长因子.3、动物体媒介培养为了提升肿瘤细胞对体外培养环境得适应与增加有活力得癌细胞(下细胞)得数量,可采用动物体转嫁接种成瘤后,再从动物体内取出进行培养,能提升体外培养得成功率,受体动物以裸鼠

20、最好、方法如下：(1)瘤块接种取新鲜瘤组织,用Hanks液洗净血污,切成l3mmT、块,用穿刺针头吸一小瘤块,于皮下注入瘤块.(2)待肿瘤生长达较大体积后剥取出瘤组织.(3)进行体外培养.(4)为预防失败,可取局部瘤细胞在裸鼠体内传代,通过裸鼠媒介接种,使肿瘤干细胞数量增多,细胞易于培养成功.(六)肿瘤细胞体外培养应注意得事项1、在原代培养时应注意得问题(1)培养材料应取自肿瘤细胞集中、活力较好得局部,取材后应立即培养并存放于培养液中、(2)取材与培养过程中要预防细菌与禹菌污染.(3)培养物中混有得成纤维细胞要尽快去除.(4)癌组织中假设有淋巴细胞浸润,应采用密度离心法将淋巴细胞去除,否那么癌

21、细胞会被杀死、(5)实验要预防英她细胞株得交叉污染.2、在传代肿瘤细胞培养时应注意得问题(1)当癌细胞没有生长到足够得量时,应耐心等待,坚持换液,不要急于传代.(2)癌细胞经常重叠生长,如果混有成纤维细胞,应在传代时采用消化消除法及反复贴壁法加以清除,别离出癌细胞进行传代培养.(3)在传到10代前细胞生长繁殖极不稳左,传代要小心,该合并培养时还得合并,千万不能传代.要确定适合该细胞得培养方法.(4)在早期传代时要适当提升接种浓度.(5)对于增殖水平极低得细胞,应放入饲养层中培养,并参加一些促生长物质,如胰岛素、氢化考得松、雌激素、EGF、软铁蛋白等因子、(6)消除成纤维细胞始终为癌细胞培养中得重要条件,一旦发现应尽早尽快按上述介绍得方法加以去除.(七)人类恶性肿瘤连续性细胞系(株)得建系(株)标准1、共同特征能在体外培养半年以上(或20代以上),生长稳泄,保持特性,能连续传代得,可称为连续性细胞系(株卜要具备如下原始资料：(2)标本来源要记录患者姓需、年龄、性别、临床诊断得疾病类别与分期.(3)标本收集日