淀粉酶活力测定

1、淀粉酶活力的测定一、目的学习和掌握测定淀粉酶包括a-淀粉酶和B-淀粉酶活力的原理和方法.二、原理淀粉是植物最主要的贮藏多糖,也是人和动物的重要食物和发酵工业的根本原料.淀粉经淀粉酶作用后生成葡萄糖、麦芽糖等小分子物质而被机体利用.淀粉酶主要包括a-淀粉酶和B-淀粉酶两种.a-淀粉酶可随机地作用于淀粉中的a-1,4-糖甘键,生成葡萄糖、 麦芽糖、 麦芽三糖、 糊精等复原糖,同时使淀粉的粘度降低,因此又称为液化酶.B-淀粉酶可从淀粉的非复原性末端进行水解,每次水解下一分子麦芽糖,又被称为糖化酶.淀粉酶催化产生的这些复原糖能使3,5-二硝基水杨酸复原,生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸,其反响如下

2、：淀粉酶活力的大小与产生的复原糖的量成正比.用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线,用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的复原糖的量,以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力.淀粉酶存在于几乎所有植物中,特别是萌发后的禾谷类种子,淀粉酶活力最强,其中主要是a-淀粉酶和B-淀粉酶.两种淀粉酶特性不同,a-淀粉酶不耐酸,在以下迅速钝化.B-淀粉酶不耐热,在70c15min钝化.根据它们的这种特性,在测定活力时钝化其中之一,就可测出另一种淀粉酶的活力.本实验采用加热的方法钝化B-淀粉酶,测出a-淀粉酶的活力.在非钝化条件下测定淀粉酶总活力a-淀粉酶活力+B-淀粉酶活力,再减去a-淀粉酶的活力,

3、就可求出B-淀粉酶的活力.三、实验材料、主要仪器和试剂萌发的小麦种子芽长约icm2 .仪器1离心机2离心管3研钵4电炉5容量瓶：50mL1,100mLX16恒温水浴720mL具塞刻度试管X138试管架9刻度吸管：2mLX3,1mLX2,10mLX110分光光度计3.试剂均为分析纯1标准麦芽糖溶液 1mg/mL:精确称取100m皱芽糖,用蒸储水溶解并定容至100mL（2）3,5-二硝基水杨酸试剂：精确称取3,5-二硝基水杨酸1g,溶于20mL2mol/LNaOH溶液中,参加50mL蒸储水,再参加30g洒石酸钾钠,待溶解后用蒸储水定容至100mL盖紧瓶塞,勿使CO进入.假设溶液混浊可过滤后使用.（

4、3）L的柠檬酸缓冲液A液：L柠檬酸：称取GHO凡O21.01g,用蒸储水溶解并定容至1L.B液：L柠檬酸钠：称取NaGHO-2H2O29.41g,用蒸储水溶解并定容至1L.取A液55mL与B液145mL混匀,既为的柠檬酸缓冲液.（4）1%S粉溶液：称取1g淀粉溶于100mLL的柠檬酸缓冲液中.四、操作步骤1 .麦芽糖标准曲线的制作取7支干净的具塞刻度试管,编号,按表1参加试剂:试剂管号1234567麦芽糖标准液mD0蒸储水mD0麦芽糖含量m03,5-二硝基水杨酸mD摇匀,置沸水浴中煮沸5min.取出后流水冷却,加蒸储水定容至20mL以1号管作为空白调零点,在540nm波长下比色测定光密度.以麦

5、芽糖含量为横坐标,光密度为纵坐标,绘制标准曲线.2 .淀粉酶液的制备称取1g萌发3天的小麦种子芽长约1cnj,置于研钵中,参加少量石英砂和2mL蒸储水,研磨匀浆.将匀浆倒入离心管中,用6mL蒸储水分次将残渣洗入离心管.提取液在室温下放置提取1520min,每隔数分钟搅动1次,使其充分提取.然后在3000r/min转速下离心10min,将上清液倒入100mL容量瓶中,加蒸储水定容至刻度,摇匀,即为淀粉酶原液,用于a-淀粉酶活力测定.吸取上述淀粉酶原液10mL放入50mL容量瓶中,用蒸储水定容至刻度,摇匀,即为淀粉酶稀释液,用于淀粉酶总活力的测定.2.酶活力的测定：取6支干净的试管,编号,按表2进

6、行操作.B-淀粉酶活力=a+P淀粉酶总活力a-淀粉酶活力酶活力测定取样表a-淀粉酶活力测定3-淀粉酶活力测定I-1I-2I-3n-4n-5n-6淀粉酶原液mD预保温将各试管和淀粉溶液置于40c恒温水浴中保温10min1%粉溶液mD保温在40c恒温水浴中准保证温5min3,5-二硝基水杨酸mD0将各试管摇匀,显色后进行比色测定光密度,记录测定结果,操作同标准曲线五、结果计算计算I-2、I-3光密度平均值与I-1光密度之差,在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量m.,按以下公式计算a-淀粉酶的活力.a-淀带酯活力变芽糖毫克数/样品鲜市幻,5分钟_麦芽糖含状淀粉的原液总体积辽样品承耳计算n-2、n-3光密

7、度平均值与n-1光密度之差,在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量m.,按下式计算a+B淀粉酶总活力.C却商淀粉除总活力麦芽糖毫克数/样品鲜重g 5分钟二龙芽糖含玳mg乂淀粉原液总体枳稀释倍数六、附注操作工程钝化3-淀粉酶淀粉酶稀释液mD03,5-二硝基水杨酸mD置70c水浴15min,冷却00000.0(1)样品提取液的定容体积和酶液稀释倍数可根据不同材料酶活性的大小而定.(2)为了保证酶促反响时间的准确性,在进行保温这一步骤时,可以将各试管每隔一定时间依次放入恒温水浴,准确记录时间,到达5min时取出试管,立即参加3,5-二硝基水杨酸以终止酶反响,以便尽量减小因各试管保温时间不同而引起的误差.同时恒温水浴温度变化应不超过土0.5C.(3)如果条件允许,各实验小组可采用不同材料,例如萌发1d、2d、3d、4d的小麦种子,比拟测定结果,以了解萌发过程中这两种淀粉酶活性的变化.七、思考题1 .为什么要将I-1、I-2、I-3号试管中的淀粉酶原液置70c水浴中保温15min?2.为什么要将各试管中的淀粉酶原液和1崛粉溶液分别置于40c水浴中保温？1.由于B-淀粉酶不耐热,70C15min被钝化,所以将此3个试管中的溶液在70c保温15m