毕赤酵母试验操作手册

1、精心整理毕赤醉母表达实验手册大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产本钱低.然而,许多蛋白质在译后,需经过译后的修饰加工,如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式.大肠杆菌缺少上述加工机制,不适合用于表达结构复杂的蛋白质.另外,蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构,在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠,是以包含体状态存在.包含体的形成虽然简化了产物的纯化,但不利于产物的活性,为了得到有活性的蛋白,就需要进行变性溶解及复性等操作,这一过程比拟繁琐,同时增加了本钱.与大肠杆菌相比,酵母是低等真核生物,具有细胞生长快,易于培养,遗传操作简单等

2、原核生物的特点,又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工,修饰,合理的空间折叠等功能,非常有利于真核基因的表达,能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的缺乏.因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用.大肠杆菌是用得最多、 研究最成熟的基因工程表达系统,当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的,其主要优点是本钱低、产量高、易于操作.但大肠杆菌是原核生物,不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰水平,其产物往住形成没有活性的包涵体,需要经过变性、复性等处理,才能应用.近年来,以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视,主更是由于酵母是单细胞真核生物,不但具有大肠杆菌易操作

3、、繁殖快、易于工业化生产的特点,还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能,预防了产物活性低,包涵体变性、复性等等问题1.与大肠杆菌相比,酵母是单细胞真核生物,具有比拟完备的基因表达调控机制和对表达产物的力口工修饰水平,人们对酿酒酵母(Saccharomyces.Cerevisiae)分精心整理精心整理子遗传学方面的熟悉最早,酿酒酵母也最先作为外源基因表达的酵母宿主.1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因一干扰素基因,随后又有一系列外源基因在该系统得到表达.虽然干扰素和胰岛素已大量生产并在人群中广泛应用,但很大局部表达由实验室扩展到工业规模时,培养基中维特质粒高拷贝数的选择压力消失,质粒

4、变得不稳定,拷贝数下降,而大多数外源基因的高效表达需要高拷贝数的维特,因此引起产量下降.同时,实验室用培养基复杂而昂贵,采用工业规模能够接受的培养基时,往往导致产量的下降.为克服酿酒酵母的局限,人们开展了以甲基营养型酵母methylotrophicyeast为代表的第二代酵母表达系统2.甲基营养型酵母包括：Pichia、Candida等.以Pichia.pastoris毕赤巴斯德酵母为宿主的外源基因表达系统近年来开展最为迅速,应用也最为广泛,已利用此系统表达了一系列有重要生物学活性的蛋自质.毕赤酵母系统的广泛应用,原因在于该系统除了具有一般酵母所具有的特点外,还有以下几个优点1、2、3;具有醇

5、氧化酶AOX值因启动子,这是目前最强,调控机理最严格的启动子之o表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合.即同源重组菌株易于进行高密度发酵,外源蛋白表达量高.毕赤酵母中存在过氧化物酶体,表达的蛋白贮存其中,可免受蛋白酶的降解,而且减少对细胞的毒害作用.Pichia.pastoris基因表达系统经过近十年开展,已根本成为较完善的外源基因表达系统,具有易于高密度发酵,表达基因稳定整合在宿主基因组中,能使产物精心整理精心整理有效分泌并适当糖基化,培养方便经济等特点.利用强效可调控启动子AOX1已高效表达了HBsAgTNFEGF破伤风毒素C片段、 基因工程抗体等多种外源基因,证实该系

6、统为高效、实用、简便,以提升表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统,而且非常适宜子扩大为工业规模4.目前美国FDA已能评价来自该系统的基因工程产品,最近来自该系统的Cephelon制剂已获得FDAB准,所以该系统被认为是平安的.Pichia.pastoris表达系统在生物工程领域将发挥越来越重要的作用,促进更多外源基因在该系统的高效表达,提供更为广泛的基因工程产品2、3.近年来,Invitrogon公司开发了毕赤酵母表达系统的系列产品,短短几年已经有300多种外源蛋自在该系统得到有效表达,被认为是目前最有效的酵母表达系统.毕赤酵母宿主菌常用的有GS11楙口KM71两种,都具有H

7、IS4营养缺陷标记.其中,GS1150株具有AOX1SI3,是Mut+,即甲醇利用正常型； 而KM71菌株的AOX1位点被ARG4S因插入,表型为Muts,即甲醇利用缓慢型,两种菌株都适用于一般的酵母转化方法.Pichia.pastoris酵母菌体内无天然质粒,所以表达载体需与宿主染色体发生同源重组,将外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达5.包括启动子、外源基因克隆位点、终止序列、筛选标记等.表达载体都是穿梭质粒,先在大肠杆菌复制扩增,然后被导入宿主酵母细胞.为使产物分泌胞外,表达载体还需带有信号肽序列.毕赤酵母表达系统有多种分泌型表达质粒,有许多蛋白在毕赤酵母得到了高效分泌表达

8、.胞外表达需要在外源蛋白的N末端加上一段信号肽序列,引导重组蛋白进入分泌途径,可使蛋白蛋白质在分泌到胞外之后获得准确的构型.毕赤酵母对外精心整理精心整理源蛋白自身的信号序列识别水平差,在本试验中所使用pPICZaA质粒,其信号肽来自酿酒酵母的a-交配因子(a-factor),能很好的到达以上的要求.并且作为新一代的毕赤酵母分泌表达质粒,它还拥有一个特点是其具有Zeocin抗性标记基因,给我们筛选转化子的工作带来很大的便利1、2.pPICZaA质粒是作为新一代的毕赤酵母分泌表达质粒,它的主要特点简介如下：具有强效可调控启动子AOX1(alcoholoxidase,醇氧化酶)；具有Zeocin抗性

9、筛选标记基因,重组转化子可直接用Zeocin进行筛选,即在YPDZF板上生长的转化子中,100%都有外源基因的整合,大大简化了重组转化酵母的筛选过程5.在操作过程中,Zeocin也可用来筛选含表达载体pPICZaA的大肠杆菌转化子,不必另外使用Amp经济而又简便；.在表达载体A0X15端启动子序列下游,有供外源基因插入的多克隆位点,多克隆位点下游有A0X13端终止序列；分泌效率强的信号肽a-factor.Invitrogen公司开发的毕赤酵母表达系统的系列产品作为目前被应用为最为广泛的酵母表达系统,其主要的优点有：醇氧化酶可调控的强启动子,能高密度发酵,重组蛋白表达量高.外源基因整合在酵母基因

10、组上,可以稳定存在.同时,高效分泌表达质粒能将外源蛋白表达后,进行译后加工处理,将外源蛋白分泌到细胞外,不但提升表达蛋白的活性,而且,有利于产物的纯化.一.毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制精心整理精心整理1. 1各种母液的配制10*YNB?含有硫酸俊、无氨基酸的13.4%酵母根底氮源培养基4c保存.34g酵母根底氮源培养基无硫酸俊+100g硫酸俊,溶于1000ml水中,过滤除菌.500*B? 0.02%生物素Biotin ?4c保存保存期为1年.20mg的生物素溶于100ml水中,过滤除菌.100*H? 0.4%Histidine组氨酸4c保存保存期为1年.400mg的L-组氨酸溶于100m

11、l水中,加热至50c以促进溶解,过滤除菌.10*D? 20%Dextrose葡萄糖 保存期为1年.200g葡萄糖溶于1000ml水中,灭菌15min或过滤除菌.?10*M?5%Methanol?酉I?保存期为2个月.将5ml的甲醇与95ml水混匀,过滤除菌.10*GY?10%Glycerol?甘油保存期为1年以上.将100ml甘油和900ml水混匀后,高压灭菌或过滤除菌.100*AA? 0.5%ofeachAminoAcid,各种氨基酸？4c保存保存期为1年.分别将500mg的L-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸溶于100ml水中,过滤除菌.1M磷酸钾溶液potassi

12、umphosphatebuffer,pH6.0,将1mol/L的K2HPO4s液132ml与1mol/L的KH2PO给液868ml混匀,其pH为6.0,如需调节pH,那么使用磷精心整理精心整理酸和氢氧化钾调节pH=1.2常用溶液及缓冲夜1.2.1碱裂解法抽提质粒DNAT用溶液：?溶液I:50mmol/Lglucose,100mmol/LEDTA25mmol/LTrisHCI(pH8.0)溶液H:0.2mol/LNaOH1%SDS(临用时配制)溶液出：29.44gKAc,11.5mlAceticacid,加ddH2OH100ml.4c保存.1.2.210%甘油(Glycerol):将100ml甘

13、油和900ml水混匀后,高压灭菌或过滤除菌.保存期为1年以上1.2.211 nase-H2O:1ulRnase力口入1ml灭菌ddH2O4c保存.1.2.212E缓冲液：10mmol/Tris-CI(pH8.0),lmmol/L?EDTA(pH8.0)1.2.213TE缓冲液：0.1mol/L,?10mmol/LTris-HCl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0)1.2.214CE缓冲液:精心整理精心整理1mol/LSorbitol(山梨醇),10mmol/L柠檬酸钠,10mmol/LEDTA1.2.215 Mpotassiumphosphatebuffer(pH6.0):?1

14、32ml1M?K2HPO4?868ml1M?KH2PO41.2.850XTAE琼脂糖凝胶电泳缓冲液,pH8.0(1L):?242g?Tris?57.1ml?AceticAcid?37.2g?EDTA二.毕赤酵母表达的培养基配制52.1?LB(LuriaBertani)培养基：?Trypton?l%?YeastExtract?0.5%?NaCl?%?PH7.0制作平板时参加2%琼脂粉.121c高压灭菌20min.可于室温保存.用于培养pPICZaA原核宿主菌TOP10F时可参加Zeocin25ug/ml.精心整理精心整理2.2 ?LLB(LowSaltLB)培养基：?Trypton?l%?Yea

15、stExtract?0.5%?NaCl?0.5?PH7.0制作平板时参加2%琼脂粉.121c高压灭菌20min.可于室温保存数月.用于培养pPICZaA原核宿主菌TOP10F时,参加Zeocin25ug/ml,可以4c条件下保存12周.2.3 ?YPD又称YEPDYeastExtractPeptoneDextroseMedium,(YeastExtractPeptoneDextroseMedium,酵母浸出粉/胰蛋白陈/右旋葡萄糖培养基?Trypton?2%dextrose(glucose)?2%+agar?2%+Zeocin?100pg/ml液体YPDW养基可常温保存；琼脂YPD板在4c可保

16、存几个月.参加精心整理精心整理Zeocin100ug/ml,成为YPD监养基,可以4c条件下保存12周.2.4 ?YPDS+Zeocin培养基YeastExtractPeptoneDextroseMedium:yeastextract?1%peptone?2%dextroseglucose?2%sorbitol?1M+agar?2%+Zeocin?100gg/ml不管是液体YPDSS养基,还是YPDS+Zeocin培养基,都必须存放4c条件下,有效期12周.2.5 ?MGYMinimalGlycerolMedium最小甘油培养基34%YNB1%t油；4*10-5%生物素.将800ml灭菌水、1

17、00ml的10*YNB母液、2ml的500*B母液和100ml的10*GY母液混匀即可,4c保存,保存期为2个月.2.6 ?MGYHMinimalGlycerolMedium+Histidine最小甘油培养基+0.004%S氨酸在1000ml的MG存养基中参加10ml的100*H母液混匀,4c保存,保存期为2个月c精心整理精心整理2.7 ?RDRegenerationDextroseMedium葡萄糖再生培养基含有：1mol/L的山梨醇；2%9萄糖；1.34%YNB4*10-5%生物素；0.005%基酸1 .?将186g的山梨醇定容至700ml,高压灭菌；2 .?冷却后于45c水浴；3 .?将

18、100ml的10*D、100ml的10*YNB2ml的500*B;10ml的100*AA等母液和88ml无菌水混匀,预热至45c后,与步骤2的山梨醇溶液混合.4c保存.2.8?RDHRegenerationDextroseMedium+Histidine葡萄糖再生培养基+0.004%fi氨酸在RD养基配制的第三步中,在参加10ml的100*H母液,同时无菌水的体积减少至78ml即可,其余配制方法与RD相同.4c保存.4 .9?RD及RDhff板的制备1 .?将186g的山梨醇和1520g琼脂粉定容至700ml,高压灭菌；冷却后于60c水浴；2 .?参照RD/RD限体培养基配制的步骤4,将100

19、ml的10*D、100ml的10*YNB2ml的500*B;10ml的100*AA等母液、10ml的100*H母液和8878ml无菌水混匀,预热至45c后,与步骤1的山梨醇/琼脂液混匀；3 .?迅速制备平板.4c可保存数月.精心整理精心整理4 .10?RD及RDH勺TO即脂的制备常用于酵母菌的包被1.将186g的山梨醇和7.510g琼脂粉定容至700ml,高压灭菌；冷却后于60c水浴；2.参照RD/RDK体培养基配制的步骤4,将100ml的10*D、100ml的10*YNB2ml的500*B;10ml的100*AA等母液、10ml的100*H母液和8878ml无菌水混匀,预热至45c后,与步骤

20、1的山梨醇/琼脂液混匀；3.将该TO即脂置于45c水浴冷却、保温,备用.4 .11?MD与MDHMinimalDextroseMedium+Histidine?最小葡萄糖培养基+0.004%0氨酸含有：1.34%YNB；4*10-5%生物素；2%萄糖1 .?100ml的10*YNB2ml的500*8和100ml10*D母液,用800ml的无菌水定容至1000ml即可；2 .?如配制MDH可在上述的MD中参加10ml的100*H即可；3 .?如配制平板,可无菌水的灭菌前,参加1520g的琼脂.4c可保存数月.2.12?SOC培养基：?Trypton?l%?YeastExtract?0.5%?Na

21、Cl?0.05精心整理精心整理?Glucose1mol/L?2%121c高压灭菌20min,冷却后,4c保存三.主要试验环节的操作3.1酵母菌株的别离纯化?接种GS115r5mlYPC体培养基,30C,200rpm振荡过夜,涂布YPDF板,30C培养48小时,用YNBS本培养基和含His的补充培养基作点种别离纯化,挑选在补充培养基生上生长而在根本培养基上不生长的单菌落划YPDF板,4C保存.3.2 pPICZaA原核宿主菌TOP10F的活化培养TOP10F做为菌种彳存在-70C条件下,在进行扩大培养抽提质粒之前,先要进行活化培养.接种TOP10F于5mlLLB参加25ug/mlZeocin中,

22、37C,200rpm,培养1618小时.3.3毕赤酵母表达的试验方法?为了预防载体质粒DNA勺自身环化,用小牛肠碱性磷酸酶CIP处理酶切后的质粒DNA具体操作如下：建立反响体系：线性化的质粒？35ul精心整理精心整理?10 xCIPbuffer?4ul?CIP?1ul?ddH2O?5ul?total?45ul在PCF上限制反响温度 加石蜡油封闭 ,37C,15min； 50C,15min； 56C,30min灭活.在56c未开始前停止,参加proteinseK,用于灭活CIP,参加试剂如下：反响物?45ul10 x5%SDS?7ul?10 xEDTApH8.0?7ul?proteinseK?5

23、ul.,JJJw.-I?ddH2O?6ul?total?70ul纯化使用QIAquickspinkit,根据2.2.3.3步骤进行,20ul灭菌ddH2O8fc脱纯化产物.进行1%琼脂糖凝胶电泳,120V,观察纯化结果,并大约估计DNAS度.精心整理精心整理3.3.2?E.coliTOP10F感受态细胞的制备及转化取10U1TOP10F菌液,接种于200mlLB液体培养基中活化培养,37C,200rpm,1618小时.取100ul菌液接种于200ml液体LB培养基中.37C,200rpm,培养1618小时.灭菌500ml离心管,4C,4000rpm,20min.得菌体沉淀.弃上清,菌体用10%

24、甘油重悬并洗涤.重复洗涤3次.第三次离心后,弃绝大局部上清,留下约1ml液体用于重悬菌体.从制得的感受态细胞中,取200ul于灭菌EP管中,参加连接反响产物5ul,混匀,不要产生气泡,在冰上放置5min.将混匀后得200ul菌液移入电击杯中.使用电击穿孔仪进行转化,设置为电压2500V,时间5ms电击后,往电击杯中参加800ulSOC培养基,冲洗出菌体,转移至灭菌1.5mlEP管中.37C,150rpm,轻摇4560min.取全部均匀涂布于含Zeocin25ug/ml的LLBZeocin平板上,正放,待涂布液不在流动,37c培养1216小时.*注：设空载体做对照.3.4 ?毕赤酵母电转化方法3

25、.4.1菌体的准备：精心整理精心整理1 .?挑取酵母单菌落,接种至含有5mlYPDt养基的50ml三角瓶中,30C、250300r/min培养过夜；2 .?取100500口的培养物接种至含有500ml新鲜培养基的2L三角摇瓶中,2830C、250-300r/min培养过夜,至OD60Cfe至U1.31.5;3 .?将细胞培养物于4C,1500g离心5min,用500ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；4 .?按步骤3离心,用250ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；5 .?按步骤3离心,用20ml的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；6 .?按步骤3离心,用1ml的冰预冷的1mol的山

26、梨醇溶液将菌体沉淀重悬,其终体积约为1.5ml;7 .?备注：可将其分装为80口一份的包装冷冻起来,但会影响其转化效率2周之内.3.4.2电击转化：8 .?将520仙g的线性化DNA容解在510卜lTE溶液中,与80履的上述步骤6所得的菌体混匀,转至0.2cm冰预冷的电转化杯中；9 .?将电转化杯冰浴5min；10 .?根据电转化仪提供的资料,参考其他文献及屡次摸索,确定适宜的电压、电流、电容等参数,按优化的参数,进行电击；精心整理精心整理11 .?电击完毕后,参加1ml冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀,转至1.5ml的EP管中；12 .?将菌体悬液涂布于MDERDEff板上,每200600卜l涂

27、布一块平板；13 .?将平板置于30c培养,直至单个菌落出现.推荐：电压1.5kV;电容25F;电阻200Q.电击时间为410mseG3.5?Pichia酵母表达直接PC蝶定重组子的方法3.5.1?模板的处理：1 .?平板上的菌落长到肉眼可见时约12小时；2 .?将除了模板之外的其它PC就应液的组分准备好,并分装.引物最好使用Kit中已有的检测专用的引物,或者一条使用载体上的引物,一条使用基因的特异性引物这样做可以鉴定非定向克隆的方向；3 .?用半根灭菌的牙签 节约,而且好用 挑取菌落,在PCRT中涮以下,放入一个灭菌的1.5毫升离心管,对PCRt和1.5毫升离心管编号；4 .?PCR扩增,1

28、%agarose电泳；5 .?对于PCFT增显现特异性条带的克隆,把置于1.5毫升离心管中的半截牙签扔到5毫升YPDZW养基中,30度培养,812小时后提质粒,酶切鉴定确认.注意：本试验方法应用在需要挑取的克隆较多也就是克隆效率低,使用PC刚筛可以使工作量大为降低.3.5.2PCR反响体系：精心整理精心整理?以TaKaRaTaqDNA合酶反响为例：组分？50小体系？20小体系10 xReactionBuffer?5.0仙l?2.0l25mmol/LMgCl2?3.0Pl?1.2l2.5 mmol/LdNTPs?5.0l?3.0lPrimeri(10mol/L)?2.5口？1.0lPrimer2

29、(10mol/L)?2.5口？1.0lddH2O?31.5pl?12.6口TaqDN艘合酶？0.5口?0.2口TOTAL?50.0pl?20.0口2.6 .3PCR反响条件：初始变性？94c?4min?变性？94c?30s?34个循环退火？5054c30s?延伸?72C?30s?结束延伸？72c10min?精心整理精心整理保存？4C?3.6毕赤酵母基因组提取方法接种重组和空质粒转化子于5mlYPD部养基,GS115B于YPDW养基彳传片照,30C,培养1618小时.室温下,1500g离心5-10min收集菌体100U1TE(pH7.0)重悬,参加300U1EDTA(pH8.0),0.07MTr

30、is-HCl,3ul0-琉基乙醇,1ulLyticase,37c水浴30min.10000g离心510min,取沉淀,力口90ulTE重悬.200ul饱和酚,200ul氯仿,混匀,离心30s,取上层水相.参加两倍体积无水乙醇以及1/10体积的NaAC-20C放置30min；10000g离心20min,弃上清；75%醇漂洗沉淀一次；枯燥后,参加15履的TE或H2O容解,-20C备用.3.7 Mut+表型重组酵母的诱导表达实验1.挑选一单菌落,置于装有25mlMGYBMGEBMGYJ养基的250ml摇瓶中,于28-30C/250-300rpm培养至OD600=2-6(16-18h);2.室温下15

31、003000g离心5min,收集菌体,用MMBMMEBMM重悬菌体,使OD600=1.0左右(约100200ml);3 .将步骤2所得的菌液置于1L的摇瓶中,用双层纱布或粗棉布封口,放置于28-300精心整理精心整理C/250-300rpm的摇床上继续生长；4.每24h向培养基中添加100%甲醇至终浓度为0.51.0%;5.按时间点分别取菌液样品,取样量为1ml,置于1.5mlEP管中,最大转速离心23min,分别收集上清和菌体,分析目的蛋白的表达量和菌液最正确收获时间.时间点一般取：0、6、12、24、36、48、60、72、84和96h;6.对分泌表达,别离样品的上清液；对胞内表达,别离样

32、品的菌体沉淀,带检测样品用液氮或干冰速冻后,于-800C保存备用；7.可以用SDS-PAGEWestern-Blot及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达.8 .7Muts表型重组酵母的诱导表达实验1.挑选一单菌落,置于装有25mlMGYBMGEBMGY&养基的250ml摇瓶中,于28-30C/250-300rpm培养至OD600=2-6(16-18h);2.室温下15003000g离心5min,收集菌体,用1/5到1/10原培养体积的MMBMM或BMMYI悬菌体(约1020ml);3.将步骤2所得的菌液置于100ml的摇瓶中,用双层纱布或粗棉布封口,放置于28-300C/250-300r

33、pm的摇床上继续生长；4.每24h向培养基中添加100%甲醇至终浓度为0.51.0%;5.按时间点分别取菌液样品,取样量为1ml,置于1.5mlEP管中,最大转速离心23min,分别收集上清和菌体,分析目的蛋白的表达量和菌液最正确收获时间.时间点一般取：0、24、48、72、96和120h;精心整理精心整理6.对分泌表达,别离样品的上清液；对胞内表达,别离样品的菌体沉淀,带检测样品用液氮或干冰速冻后,于-800C保存备用；7.可以用SDS-PAGEWestern-Blot及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达.四试验的考前须知4.1信号肽识别位点的设计?以质粒pPICZaA为例.在利用PC阪应在外

34、源基因两端引入酶切位点的试验中.如果质粒pPICZaA双酶切中丧失了KEX2白酶的酶切位点LysArg,应该在上游中,增加了编码Lys、Arg的密码子AAAAGA酵母细胞膜中中的KEX渣白酶是a-factor信号肽的切割酶,它能有效识别酶切位点Lys-Arg,通过对信号肽的切割使基因表达产物释放至胞外.4.2 PCR产物酶切保护碱基的设计?利用PCR专换酶切位点,通过P3、P4两引物的扩增在rhEGF的两端加上Xhol、Xbal的识别位点和5个保护碱基.根据限制性核酸内切酶的工作原理,内切酶首先需要结合到核甘酸序列上,并在上LI面进行滑行,直至识别到酶切位点,为了能使内切酶有效的结合到序列上以

35、利于其的有效加工.在利用PCR!行酶切位点转换的时候,通常应在5端限制酶位点外再加3个保护碱基GC6,预防引物合成中由于合成效率和纯化问题而导致的酶切位点的残缺.核甘酸保护碱基之为了保证限制型内切酶的工作效率,在其识别位点的两侧应该保精心整理精心整理证一定的旁侧序列,换言之,识别位点是限制型内切酶识别并特异性切割底物的必要而不充分的条件.鉴于NEB(NewEnglandBiolabs)公司在限制酶领域的总体研究水平和对保护碱基方面的独到理解,在设计引物时可以参照NE您司的产品目录后面的附录：CleavagetotheendofDNAfragments进行7,但是,一些不常用的酶或虽有推荐的保护

36、碱基序列但酶切效率仍不高的酶还是很难设计保护碱基.本次实验中,根据美国基因动力实验室文献的报道8;XbaI、NheI和SpeI位点5端保护碱基须在5个左右才容易被酶切割,以及一些前人的经验总结,我们在设计引物时在识别位点5端,设计了5个保护碱基.以保证较高的酶切效率.4.3高保真DNA合酶的使用?VentDNA聚合酶是从高温嗜热菌中分高出的高保真(HighFidelity)耐高温DNAK合酶,能纠正DNAT增中产生的错误,而传统的TaqDNAS合酶,TthDNA聚合酶及其变体AmpliTaq,KlenTaq等都无3至5纠错功能,因此在扩增时出现碱基错配的机率为2.1x104.这对于大批量的PC

37、RT物而言,并不是十分严重的问题,由于又同样错误的DNA子仅占全部合成的DN砌子群体的极少一局部.但是,如果PCR扩增的DNAt段是用于分子克隆,那么这就是件值得重视的事情,由于此种分子含有一个或数个错误掺入的核甘酸,那么在该克隆中的所有克隆DNATB将带有同样的“突变.将会导致严重的后果9.具有校正功能的DNAK合酶还有Pfu,DeepVent,PwqUlTma等,Pfu是其中出错率最低的,比TaqDNAK合酶低10倍.在本论文中,为了减少hEGF&PCRS程的错误扩增,在人工合成hEGF勺过程中使用了VentDN咪合酶.随着PCRK术的不断开展成熟(扩增长度、保证性、产量和特异性等

38、),质粒构建过程的大多数细胞内的DNAS制将被PCRS一细月 fi 外的DNAS制所代替,质粒构建精心整理精心整理效率将有质的飞跃.4.4密码子的偏好性的原那么?酵母菌对外源基因的表达也和外源基因密码子的选用有关.了解表达系统宿主在密码子使用上的偏爱性对从译水平分析外源基因表达的规律有重要意义,也为改造外源基因或改造宿主细胞提供依据10、11.4.5线性化及采用电转化的原因：在pPICZaA-EGF电转整合入GS115勺时候,由于需要比拟高的转染率,我们对其用限制性内切酶Sacl进行线性化的处理.细菌内同源重组被认为是重组质粒构建过程的难点.由于未线性化的环状质粒之间发生同源重组的几率非常低,

39、所以重组转移载体必须用特定的限制性内切酶进行线性化处理.这种处理的目的：预防随机插入重组时质粒在功能区断开,造成目的基因表达失活；让同源重组以指定的方式发生.4.6乙醇沉淀法的问题主要步骤如下：1酶切体系80ul中2倍体积的无水乙醇加1/10体积的PH5.2NaAC混匀2-20C20分钟沉淀313200rpm,20min,离心后弃上清精心整理精心整理475%ZJI300ul轻轻洗,同上离心5min,弃上清537度烘箱至无乙醇气味或是用摇床的出风口吹出的暖风吹.620ulddH2O重溶如果想提升转化效率,可以稍微做一些改良：1.还是用酚抽一下,去除内切酶；2.75叱醇应洗两遍,尽可能去除盐离子,预防电转化杯被击穿,同时可提升效率；3.在沉淀时,如用终浓度2.5M的醋酸钠+2.5倍体积的无水乙醇,可沉淀几乎所有的DNA但需要用75%勺乙醇认真的洗两遍.4.6酶切的总结影响重组质粒构建效率的最关键步骤在于酶切,不管是否是定向克隆还是非定向克隆.酶切的关键在于切干净,彻底的酶切反响是成功的一半,特别是载体的酶切,尤其是双酶切.双酶切一般是先反响低盐buffer的、后反响高盐buffer的,如果低盐buffe