抗乙酰胆碱受体单链抗体与人血清白蛋白融合基因真核表达载体的构建

1、抗乙酰胆碱受体单链抗体与人血清白蛋白融合基因真核表达载体的构建 作者：魏晶，李强，范华英，李芳芳，李红花，李英信，孟繁平 【摘要】 目的构建真核表达体系，提高抗人乙酰胆碱受体单链抗体（ScFv637）与人血清白蛋白（HSA）融合基因（ScFv637HSA）的蛋白表达质量.方法扩增ScFv637HSA融合基因，经酶切处理后，克隆至真核载体pPIC9K，线性化处理后，电穿孔入毕赤酵母GS115.结果经电泳观察可见相对分子质量为2.6kbp的融合蛋白ScFv637HSA基因和真核表达载体pPIC9K基因片段.结论ScFv637HSA基因已准确地整合到毕赤酵母染色体基因组中. 【关键词】 重症肌无力；

2、抗体；融合基因；真核表达 Construction of eukaryotic expression vector of a fusion gene of single chain variable fragment directed against acetylcholine receptor with human serum albumin ABSTRACT:OBJECTIVETo increase the protein expression level of fusion gene of single chain variable fragment (ScFv637) and huma

3、n serum albumin (HSA) by using eukaryotic expression system.METHODSThe fusion gene (ScFv637HSA) was amplified and cloned into pPIC9K to construct recombinant vector pPIC9KScFv637HSA. The recombinant vector was linerized and transformed into Pichia Pastoris GS115 by electroporation.RESULTSThe sizes o

4、f the fusion gene and the pPIC9K were found to be approximately 2.6kbp and respectively.CONCLUSIONThe eukaryotic expression vector, which bears the fusion gene of ScFv637HSA, has been successfully constructed. Key words:myasthenia gravis;single chain variable fragment;fusion gene;eukaryotic expressi

5、on 重症肌无力是抗乙酰胆碱受体抗体介导的依赖细胞免疫及补体参与的器官特异性自身免疫病,抗乙酰胆碱受体抗体的抗原结合片段（fragment of antigen binding，Fab）分别与神经肌肉接头处突触后膜乙酰胆碱受体上2个相邻的亚单位结合后，通过加速乙酰胆碱受体发生抗原调变及激活补体，使乙酰胆碱受体数量减少，出现肌无力和麻痹症状1.由抗乙酰胆碱受体亚单位主要免疫原区抗体制备的抗原结合片段或单链抗体（single chain variable fragment, ScFv）与乙酰胆碱受体的主要免疫原区结合后，可特异性地封闭致病性抗体与乙酰胆碱受体的结合位点，从而对乙酰胆碱受体起到保护作

6、用2.本实验室曾制备了人源性抗乙酰胆碱受体主要免疫原区的单链抗体ScFv6373，为了克服ScFv637半衰期短的缺点，又将其与人血清白蛋白（human serum albumin, HSA）相连，构建了ScFv637HSA融合基因4.为提高融合蛋白的表达质量，选择了真核表达系统. 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种与质粒 大肠杆菌DH5由荷兰马斯特里赫特大学医学院神经系神经免疫学实验室提供，质粒pPIC9K及毕赤酵母菌GS115由军事医学科学院输血研究所章金刚教授惠赠. 1.1.2 试剂 限制性核酸内切酶SnaB ，EcoR 和T4DNA连接酶为美国NEB公司产品；Sal为大连T

7、AKARA公司产品；High Fidelity PCR System5Kb，氨苄青霉素及其他化学试剂均为华美生物工程公司产品；Wizard Plus Minipreps/Midipreps DNA Purification System为美国Promega公司产品；TAKARA DNA ATailing Kit，TAKARA DNA Ligation Kit和pMD18T Simple Vector均为大连TAKARA公司产品. 1.1.3 引物合成 根据原核表达载体pHEN2ScFv637HSA4中ScFv637前10位氨基酸序列设计5引物，再根据cmyc后10位氨基酸互补核苷酸序列设计3引

8、物，VH 5引物为GACTTACGTAGAGGTGCAGCTGCTGGAG，cmyc 3引物为CGGAATTCATTCAGATCCTCTTCTGAGATG，其中画线部分分别引入了SnaB和EcoR限制性酶切位点，引物由大连TAKARA公司合成. 1.2 方法 1.2.1 PCR扩增ScFv637HSA基因 在50L反应体系中依次加入无菌去离子水37.5L，20×PCR反应缓冲液（氯化镁Free）2.5L，氯化镁3L，4×dNTP1L，VH 5引物（10mol/L）1.5L，cmyc3引物（10mol/L）1.5L，模板DNA（pHEN2ScFv637HSA, 0.57g/L

9、）1L，Taq DNA 聚合酶1L (1U)，Pfu DNA聚合酶1L（1U）.反应条件为94预变性5min，94变性1min，55退火1min，72延伸4min，共进行30次循环，其后72延伸5min.取5L反应产物行琼脂糖凝胶电泳. 1.2.2 PCR产物加“A”处理及TA克隆 按Wizard PCR Preps DNA Purification System试剂盒说明书对扩增产物进行纯化，按TAKARA DNA ATailing Kit说明书对产物进行加“A”处理，按照TAKARA DNA Ligation Kit试剂盒说明书进行操作，得到ScFv637HSAT Vector.连接产物转

10、化感受态大肠杆菌DH5,挑选阳性克隆扩增后测定序列，证实其结果准确. 1.2.3 ScFv637HSA与pPIC9K连接 采用SnaB和EcoR对ScFv637HSAT Vector和pPIC9K进行双酶切，回收酶切产物切胶，用T4DNA连接酶进行连接，并将连接后的pPIC9KScFv637HSA转化至感受态大肠杆菌DH5，进行克隆. 1.2.4 重组载体的酵母转化 制备毕赤酵母GS115感受态及用于电转化的DNA样品，转化条件为：电压为1.5kV，电容为25F，电阻为200，转化时间随DNA样品的不同而变化，并由仪器自动给出，通常在3.54.0ms范围内.电转后行单菌落PCR筛选阳性转化子.

11、 2 结果 将目的基因转化至毕赤酵母GS115后，应用扩增目的片段时使用的引物进行PCR筛菌.电泳结果可发现，GS115（pPIC9KScFv637HSA）扩增出相对分子质量为2.6kbp的目的条带，表明pPIC9KScFv637HSA已准确整合到GS115菌株染色体中（Fig1）. 3 讨论 在PCR扩增过程中，除了使用Taq DNA聚合酶以外，还应用了Pfu DNA聚合酶，该酶具有35外切校正活性，可提高PCR反应的保真性.Taq DNA聚合酶催化形成产物的3末端通常有1个非模板依赖的dA5，T载体的末端有1个悬挂的dT，刚好可与PCR产物末端的dA配对.但使用了Pfu DNA聚合酶后，该

12、酶会将PCR产物3末端的“A”切除，故在TA克隆前要先对PCR产物进行末端加“A”处理.在毕赤酵母系统中的表达载体不含酵母复制起始点，导入酵母体内的重组表达载体只有整合到酵母染色体上，外源基因才可稳定存在，外源蛋白稳定表达，整合的转化子一旦形成就非常稳定.转化后的重组表达载体若未能整合到染色体上，而以游离的附加体形式存在，这种转化子就不稳定，重组载体极易丢失.因此重组载体必须整合入酵母基因组DNA中才能实现外源基因的稳定及高表达.Wetterholm等6利用毕赤酵母表达系统进行蛋白表达，纯化后蛋白得率为0.51.0mg/L，为了得到高表达的蛋白，本实验选择了该系统.毕赤酵母的转化常使用原生质球

13、法和电穿孔法，二者转化率均较高，一般可得到高拷贝重组，其转化效率均可达到105/g，但原生质球法操作繁琐费时，而电穿孔法简便、快速及高效，是目前效率较高的DNA转化方法.制备用于电转化的GS115感受态细胞时，其OD600应控制1.31.5间，让细胞至少完成2次分裂，在细胞的第3,4次分裂期间转化效率较高且相对恒定.从酵母菌落获取模板进行PCR是快速可行的分析酵母基因组的方法7，而用酸洗玻璃珠通过物理机械作用破坏细胞，使核酸释放，再用经典的核酸纯化方法即酚氯仿抽提及乙醇沉淀的方法，可获得较好的提取效果.此种方法制备模板行PCR时，结果受模板浓度的影响小，实验结果较稳定.本实验用PCR方法扩增了

14、融合蛋白ScFv637HSA基因，克隆到中间载体后，经过酶切及连接后亚克隆至真核表达载体pPIC9K，提高了外源基因的表达质量，为后续的蛋白功能检测奠定了基础.【参考文献】 1 Engel AG, Lambert EH, Howard FM, et al.Immune complexs (IgG and C3) at the motor endplate in myasthenia gravis: ultrastructural and light microscopic localization and electrophysiologic correlationsJ.Mayo Clin P

15、roc,1977,52(5):267.2 Papanastasiou D, Poulas K, Kokla A, et al.Prevention of passively transferred experimental autoimmune myasthenia gravis by Fab fragments of monoclonal antibodies directed against the main immunogenic region of the acetylcholine receptorJ.Neuro Immunol,2000,104:124.3 Meng F, Stas

16、sen MH, Schillberg S, et al.Construction and characterization of a singlechain antibody fragment derived from thymus of a patient with myasthenia gravisJ.Autoimmunity,2002,35(2):125.4 范华英，孟繁平，齐栋，等.抗人乙酰胆碱受体scFv人血清白蛋白融合蛋白的构建及在大肠杆菌中的表达J.细胞与分子免疫学杂志，2006,22(4):507.5 Clark JM.Novel nontemplated nucleotide addition reactions catalyzed by prokaryotic and eukaryotic DNA polymerasesJ.Nucleic Acids Res,1998,16:9677.6 Wetterholm A, Molina DM, Nordlund P, et al.Highlevel expr