连接酶链反应及其应用 .doc

1、毕 业 设 计（ 论 文 ）开 题 报 告 书课 题 名 称 连接酶链反应及其应用 学 生 姓 名 学 号 系、年级专业 指 导 教 师 2012年 12 月 10 日连接酶链反应（PCR)及其应用姓名： 系别： 班级： 学号： 摘要：连接酶链反应（Ligase Chain R eation，LCR）是在连接酶扩增反应或连接酶检测反应的基础上，引入热稳定的连接酶而建立的类似PCR 技术的新方法。LCR 既可扩增，又可鉴定D N A 异常，与PCR 技术一样可用于已知病因的遗传病大面积普查。关键词：连接酶链反应（LCR）；PCR 技术； 淋病奈瑟菌; 淋球菌和沙眼衣原体; 酶联免疫吸附试验1 L

2、C R 的建立与发展近年来关于核酸的体外扩增和检测技术取得了很大进展。从M ul lis 于1 9 8 5 年发明聚合酶链反应(p o ly m e r a s e eh a in r e a e tio n , P CR ) 后,PC R 技术目前已被广泛用于基础医学、临床医学、法医学和考古学等领域。随之也出现了一些新的和改进完善的技术方法。1988 年Landegren 等率先采用寡核苷核酸连接酶分析方法来适应准确的杂交条件和电泳的需要。当两个寡核苷酸探针与变性D N A 杂交时，使其中第一探针3端与第二探针5端相邻；只要这两个寡核苷酸有正确的互补关系或配对，D N A 连接酶就可以共价地

3、将两个寡核苷酸连接起来，繁殖。若两个寡核苷酸接头处与靶核苷酸之间即使有一个碱基错配，也不能被连接和扩增。利用这种方法检测 球蛋白基因的点突变。后来，W u 和W allace（1989 年）以及Barninger 等（1990 年）利用大致相同的方法获得相同结果，如果在第一个探针上连接生物素，在第二个寡核苷酸探针上有一个非同位素报告基因，那么就利用这个反应自动地检出所获得的产物。1991 年，Barany 从Ecoli的耐热水生株H B8 D N A 的质粒文库筛选出一个稳定的、依赖N A D + 的大肠杆菌连接酶克隆，以这个克隆的热稳定连接酶代替寡核苷酸连接酶分析中的T4D N A 连接酶。

4、由于在多次热循环后连接酶仍然具有活性，因此反应体系象PCR 一样，能自动地重复进行与扩增，使反应产物按指数增长，故而命名为连接酶链反应（LCR）。LCR 技术的正式推出虽然只有1 年多的时间，它与已知PCR 齐名，被并列提为遗传病D N A 诊断两大技术之一。2 LC R 基本原理LCR ，即在D N A 连接酶的作用下，通过连接与模板D N A互补的两个相邻寡核苷酸链，快速进行D N A 片段扩增。D N A连接酶可将与模板D N A 链互补的两条毗邻寡核苷酸片段连接起来，两条寡核苷酸链接头处存在碱基错配则阻止连接反应的发生。所以通过连接酶反应，可明确区分寡聚核苷酸是否与模板D N A 完全

5、互补，检测基因点突变。耐热D N A 连接酶在不同温度组成的循环中活性保持不变。这样，在适当的缓冲体系中加入模板D N A 。一套寡聚核苷酸片段，耐热D N A 连接酶，将上述反应体系加热，使模板D N A 在高温下（94 ）一分钟变性，解链；然后将反应体系降至退火温度（65 ），4 分钟使模板寡聚核苷酸互补成双链；D N A 连接酶催化两相邻的寡核苷酸连接起来。如下图：如此循环改变温度，连接反应重复进行，使目的D N A 得到扩增。如果两寡核苷酸接头处存在错配碱基，则没有扩增产物的产生，扩增产物.可通过聚丙烯酰胺电泳加以鉴定。3 LC R 方法简述3.1 待检测D N A 的获得从适当的组织

6、标本中分离，提取染色体D N A ，煮沸5 分钟，备用。3.2 寡核苷酸片段的合成根据目的D N A 序列，利用D N A 合成仪合成与之互补的寡核苷酸片段。3.3 32P 标记寡核苷酸片段利用T4 寡核苷酸激酶，将r-32P-A TP上的r-32P标记到寡聚核苷酸A 1和B1的5-O H 上。3.4 在四个独立的LCR 反应体系中，加入两种同位素标记的寡聚A 1 和B1，模板D N A 和耐热D N A 连接酶。然后在各自体系中分别加入A 2 和B2、A 3 和B3、A 4 和B4、A 1 和A 5 和B5，使各种体系在94 热浴一分钟，而后转入65 ，孵育4 分钟。如此94，65 循环改变

7、温度2030 次。3.5 电泳和放射自显影终止反应后，将反应物进行10%聚丙烯酰胺变性胶电泳，干胶后行自显影术，分析结果。LC R 识别点突变的特异性高于P CR。尽管PC R 是一种D N A 片段扩增的极好方法, 但是检测片段中的点突变较为困难。一些基于PC R技术的点突变分析法, 包括等位基因特异性PC R 和特异性等位基因PC R 扩增, 针对每种特异性突变的条件都需要最优化, 因而使得这些技术不适于一般应用。L CR 连接反应温度接近寡核昔酸融解温度(T m ) , 识别单核昔酸错配底物的互补特异性极高。LC R 既可识别, 又可以扩增单碱基改变, 加之特殊标记的LC R 产物适用于

8、一些非放射性自动检测, 因而简便易行。但是与PC R 法比较起来,LC R 法尚处于早期发展阶段, 仍需要进一步完善。如果能将两者结合起来, 利用各自的优点, 研究者可能会获得最佳结果。4 LC R 应用前景PCR 技术特异、敏感、操作简便、易于自动操作等，使之广泛应用于生命科学、基因工程、疾病诊断、法医学，甚至考古学等各个领域。而LCR 反应中，选择特异的寡核苷酸片段为原料，严格控制解链，同样可特异地进行目的D N A 片段地快速扩增；同时，通过区分寡核苷酸与模板是否完全互补，检测出单个碱基的置换突变。对于已知基因突变类型的疾病诊断是一个有效而切实可行的方法，尤其适合大样本普查与筛选。LCR

9、 可用于以下几个方面的研究。4.1 扩增已知序列的D N A 片断。4.2 识别D N A 序列内的特异位点。4.3 通过对突变的检测，确定感染病毒亚型。4.4 联合PCR 技术，研究单基因遗传病的多态性，纠正过去的错误认识。4.5 利用固定基质作支持物，分离特定的核酸片段。4.6 将PCR 所合成的D N A 片断按一定顺序连接起来。相信随着分子医学认识的深入和发展，LCR 将与PCR 协同作用，促进遗传性疾病和某些感染性疾病（如病毒或支原体感染）的诊断，也为分子生物学研究提供新技术。5 LCR应用实例5.1连接酶链反应(LCR)技术检测男性尿标本的淋病奈瑟菌淋病是我国重点防治的性传播疾病之

10、一，也是口岸检验检疫部门重点监测的疾病，细胞培养法一直作淋病诊断的“金标准” 。但淋球菌对外界生长条件苛刻，其敏感性多受标本采集、运送条件、所培养细胞的敏感性及标本中抑制因子等因素影响，再加上不少患者接受过抗生素治疗，培养更加困难 J。LCR技术不须依赖标本中的活菌数，从理论上讲只要有一基因拷贝就可以扩增出大量的目的DNA。LCR反应扩增的目的基因为48bp的淋球菌染色体Opa一1基因片段，经过40个反应周期可使目的基因扩增10 以上 J。本文通过对流动人群和出入境人群进行LCR检测，并与PCR方法比较，参照“扩大的金标准”来确定检测结果，初步得出其敏感性为100，特异性为999，与其它研究报

11、道结果基本一致卜 ，提示LCR是一种既敏感又特异的基因诊断方法。LCR在流动人群和同期的出入境人群中的检出率为088 ，与PCR方法相比二者无显著性差异。考虑到检测成本，可在高危人群中使用LCR检测，而在一般人群中使用PCR筛检，LCR复检。另外调查发现，淋病奈瑟菌检测SCO500的阳性者大多具有临床表现，临床症状的轻重是否与LCR检测的S(X)值相关，还需扩大阳性样本检测量做进一步探讨。检测男性淋球菌感染的传统取材方法是尿道取材，但插入拭子常给患者带来痛苦，尤其是对无症状的受检人群来说更难以接受，同时可导致插入时间过短而致标本采集量不足 。而LCR技术只需采集受检者的首段尿液标本即可，免去了

12、以往采集分泌物时对患者造成的损伤性，易于为受检者所接受。5.2连接酶链反应技术在淋球菌和沙眼衣原体检测中的应用LCR 技术为淋球菌、沙眼衣原体等性传播疾病病原体的实验室检测提供了1 种突破性的方法。Gaydas 等报道4 ,以LCR 方法检测尿沉渣中的沙眼衣原体, 敏感性和特异性分别为: 男性100 %、99. 6 %;女性100 %、98. 5 % ,可见,LCR 检测技术具有高度的敏感性和特异性。Lee 等5 以LCR、PCR、酶免疫和培养等方法检测淋球菌和沙眼衣原体,以LCR的检测敏感性最好, 特异性最高。Stary 等报道6 ,LCR 技术检测淋球菌和沙眼衣原体的敏感性范围为93. 5

13、 %98 % , 特异性范围为99. 5 %100 %。LCx 及其配套试剂盒是得到美国FDA 批准的核酸扩增检测技术,该技术是1 项既高度敏感又高度特异的实验室诊断方法,适用于各种发病率人群的检测,同时,还可用于其他各种感染性疾病病原体如乙肝病毒、支原体、结核杆菌等的快速测定,在诊断肿瘤性、基因性疾病等方面也有一定的应用价值。5.3连接酶链反应一酶联免疫吸附试验诊断沙眼衣原体感染的初步应用在前期工作中，我们用电泳法检测扩增产物 。该方法虽然简便、经济，但敏感性低且存在EB污染。此外也可以将。 P标记的三磷酸脱氧核苷酸掺入反应体系，对扩增产物行经凝胶电泳后放射自显影。此法费时费力，加上放射性废

14、弃物的处理等问题而在实际工作中应用受到限制。美国Abbott实验室的自动分析诊断试剂盒LCx，对扩增产物用微粒酶免疫检测法(microparticle enzyme immunoassay，MEIA)测定。操作省时省力，总反应时间为24 h，一次可检测24份标本(包括6份对照) j。全套设备昂贵，制约了LCR在我国的开展及随后大规模的CT分子流行病学研究。本试验将ELISA方法结合非放射性标记法检测GapLCR产物，即将GapLCR所使用的两对探针的5 和3 端标记后再参与GapLCR扩增反应，从而得到3 和5 端同时带有生物素和地高辛的扩增产物，扩增后产物被包被有链霉亲和素的微孔板捕获。被捕

15、获在微孔板上的扩增产物5 端的地高辛可以被加人的抗地高辛抗体结合后，通过抗体上偶联的过氧化物酶(POD)和相应的底物ABTs结合显色，并通过自动酶标仪读取结果。此法无须更改LCR扩增步骤，只需换用标记引物，扩增后进行标准的ELISA检测法，具有易操作，稳定性好的优点，使用微孔板，一次可分析96个样品，整个过程可在3 h内完成，便于临床常规应用和流行病学研究中样本筛选。仪器读取结果客观，判断结果客观，有助于实现检测的自动化，为临床诊断CT感染提供了一个很好的试验方法。7. 展望LC R 技术从出现至今, 已受到越来越多的研究者的注意并将其应用到自身的研究领域除了以上的不完全列举之外, 利用LC

16、R 法可以作大量人群中单碱基遗传病多态性的快速筛选和单碱基遗传病的产前诊断; 微生物亚种和亚型的鉴别;多态性的分析; 法医学中个体D N A的准确鉴定; 随着癌基因研究的进一步发展,LC R 可能对某些肿瘤作出基因诊断, 如已清楚的结肠癌r a s 基因的单碱基改变; 对于一些已搞清其D N A 序列的细菌和病毒等, 均可借助于L C R 进行病原体诊断l. 。由于L C R 设计独特, 在某些方面的优势(如检测点突变) 目前尚不能为其它手段所取代, 且LC R 尚在不断完善和改进之中, 故其作为一种有效的D N A 扩增和检测技术具有很大的发展前景。参考文献：1. Landergen,ct

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