纳米肿瘤疫苗的制备工艺的优化及特性鉴定

1、纳米肿瘤疫苗的制备工艺的优化及特性鉴定11-01-31 10:23:00 作者：李侠编辑:studa201 ；一；【摘要】目的：制备无明显毒性、高效的恶性肿瘤基因工程纳米疫苗。方法：纯化融合蛋白MH,薄膜分散-超声法制备包裹 MH勺纳米脂质体肿 瘤疫苗NL（MH ,并评价其粒径、 包裹率及稳定性；观察NL（MH免疫组小 鼠的急性毒性反应，及重要脏器的病理学改变。结果：成功制备出粒径为（80± 250） nm的纳米脂质体,其药物包裹率为30%,于4C放置6个月后或3 000 r/min 10 min 离心后无分层,证明其稳定性良好；与PBS对照组相比,免 疫组小鼠未见明显毒性反应。结论

2、：该恶性肿瘤基因工程纳米疫苗具有良好的 理化性质，未见毒性反应。【关键词】肿瘤特异性抗原脂质体树突状细胞肿瘤疫苗肿瘤疫苗能诱导特异性的抗肿瘤免疫反应，在肿瘤防治上已经显示出一 定的效果,被认为是最具前景的肿瘤治疗方法。本实验室运用MAGE3/Hsp70的融合蛋白免疫小鼠,结果显示融合蛋白诱导机体产生高效的 MAGE特异性CTL,对表达MAGE3勺B16细胞有很好的杀伤效果1。为了使该融合蛋白能更好地被机体摄取且更好地靶向肿瘤组织,更有效地激活机体产生针对MAGE的特异性CTL,对表达MAGE的肿瘤细胞具有更强的杀伤作用,本部分实验中采用纳米脂质体为载体,包裹MAGE3/Hsp70勺 融合蛋白（

3、MH制备恶性肿瘤基因工程纳米疫苗。1 材料和方法1.1 材料分光光度计（UV 3000型）为日本岛津公司产品；透射电子显微镜（JEM 2000 EX型）为日立公司产品；集热式恒温加热磁力搅拌器（DF101B型）为巩义市予华仪器有限责任公司产品；20 kHz/500 watt超声粉碎仪为美国ColeParmer公司产品；RPMII640培养基购自美国Gibco公司；蛋黄卵磷脂和胆固醇为德国 Merck公司产品；其他试剂均为 进口超纯级或国产分析纯级；pET28 a （+） MAGE3/Hsp7质粒由本实验室研 制。1.2 方法1.2.1MAGE3/Hsp7（融合蛋白的纯化与鉴定MAGE3/Hsp

4、7融合蛋白的纯化见文献1。采用 Western blot 法对 MAGE3/Hsp7融合蛋白进行鉴定,即取10卩g MAGE3/Hsp70勺融合蛋白, 采用20卩L 20 mol/L PBS 重悬细胞, 加入20卩L 2X Loading Buffer, 进行 SDS PAGE 采用 80 V, 60 min 转移 PVDF膜,50 g/L 脱脂乳TTBS室温下封闭PVDF膜60 min,用TTBS 1 : 500稀释MAGE抗血清，从封闭液中取出膜，放入抗血_清中,37C 60 min 。TTBS洗膜3次每次10 min, 采用TTBS缓冲液1 : 5 000稀释HRP标记的生物素化二抗,3

5、7E 60 min,TTBS洗膜，DAB显色。1.2.2 纳米脂质体的制备及工艺优化采用薄膜分散 超声法制备纳米疫苗， 选用4因素、3水平正交设计进 行工艺优化见表1（4个因素分别为大豆卵磷脂和胆固醇摩尔比（A）、脂和水 体积比（B）、超声时间（C）、PBS的pH值（D）,以包封率为考察指标来 筛选处方）。脂质体具体制备步骤如下：秤取处方量的大豆卵磷脂和胆固醇 100 mL烧瓶中，加入氯仿12 mL, 置于6570C水浴中，于旋转蒸发仪上旋转，减压除去氯仿，得到磷脂膜。另取溶有目的蛋白（1 g/L ）的PBS（ pH=7.5± 0.5） 20 mL于小烧杯中， 同置于6570C 水浴

6、中， 保温 待用。取预热的PBS,加至含有磷脂膜的烧瓶中，6570C水浴中搅拌水 化1020 min,即成脂质体液。取出该液于烧杯中，置于磁力搅拌器上, 室温下搅拌3060 min。冰水浴条件下超声1020 min,即得脂质体胶体液。0.1 卩m聚碳酸树脂纤维过滤3次，整粒，得粒径较均匀的脂质体。用0.22卩m的滤膜过滤除菌后， 于4°C保存。表1 各个因素不同配比的正交设计（略）1.2.3 NL （MH的性质鉴定（1）形态观察：将制成的NL（ MH 500倍稀释于生理盐水中， 取100卩L 滴于400目铜网上，1 min后吸去上清，10 g/L 磷钨酸负染色1 min, 自 然晾干

7、后在透射电子显微镜下观察其形态。将采集的图象经计算机图象分 析， 求得NL（ MH的平均粒径。 包裹率及稳定性测定：采用Sephedex G100凝胶层析法，洗脱液为PBS, 流速为0.5 mL/min。取NL （MH 1.0 mL上柱，收集游离峰即为游离的MH同时制备不同浓度的 MH标准蛋白样品，Bradford法测定蛋白的含 量， 计算出NL （MH中游离MH的含量。将制备的NL （MH置于4C冰箱保 存6个月后或3 000 r/min 10 min离心后， 电镜观察纳米脂质体形态， 明确其稳定性。包封率=（系统中的总药量液体介质中未包封的药量）/系统中的总药量X 100% （3）纳米疫苗

8、急性毒性：实验取二级条件C57BL/6小鼠20 只，雌雄不拘，随机分为2组，每组10只。PBS对照组：腹腔注射PBS1.0 mL/鼠；纳米疫苗（NL（ MH组）：腹腔注射包封MH的最大浓度0.3 g/L 的纳米疫苗，1.0 mL/鼠，观察实验鼠有无急性中毒表现，并记录两周内 死亡小鼠的只数。实验结束时处死动物、剖检（肉眼观察主要脏器的大小、硬度、有无胸腹腔积液等）、取心脏、 肝脏、脾脏、肺脏、肾脏， 用4g/L的甲醛固定，石蜡包埋，HE染色，行病理组织学观察。1.2.4 统计学处理应用SPSS11.5统计软件进行数据分析，P<0.05表示有统计学意 义， 计量数据结果均以x±s表示。组间差异性比较采用2 结果2.1MAGE3/Hsp70融合蛋白的纯化与鉴定含有 pET28a （+） MAGE3/Hsp7质粒的 BL2