第16章高效液相色谱法#

1、第 16 章高效液相色谱法【 16-1】 从分类原理、仪器构造及应用范围，简述气相色谱及液相色谱的异同点。 答：二者都是根据样品组分与流动相和固定相相互作用力的差别进行分离的。 从仪器构造上看，液相色谱需要增加高压泵以提高流动相的流动速度，克服阻力。同时液相色谱所 采用的固定相种类要比气相色谱丰富的多，分离方式也比较多样。气相色谱的检测器主要采用热导 检测器、氢焰检测器和火焰光度检测器等。而液相色谱则多使用紫外检测器、荧光检测器及电化学 检测器等。但是二者均可与 MS 等联用。二者均具分离能力高、灵敏度高、分析速度快，操作方便等优点，但沸点太高的物质或热稳定性差 的物质难以用气相色谱进行分析。

2、 而只要试样能够制成溶液， 既可用于 HPLC 分析， 而不受沸点高、 热稳定性差、相对分子量大的限制。【 16-2】 高效液相色谱仪由几大部分构成？各部分的主要功能是什么？ 答：高效液相色谱仪由高压输液系统，进样系统，分离系统，检测系统和记录系统五大部分组成。 高压输液系统：主要是通过高压输液泵将溶剂储存器中的流动相以高压形式连续不断地送入液路系 统，使试样在色谱柱中完成分离过程。进样系统：把分析试样有效地送入色谱柱中进行分离。 分离系统：将试样各组分分离开来。检测系统：对被分离组分的物理或物化特性有响应；对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应。 记录系统：记录被分离组分随时间变化的信号。【

3、16-3】 液相色谱中影响色谱峰展宽的因素有哪些 ? 与气相色谱相比其主要区别何在？ 答：液相色谱中引起色谱峰扩展的主要因素为涡流扩散、流动的流动相传质、滞留的流动相传质以 及柱外效应。 在气相色谱中径向扩散往往比较显著，而液相色谱中径向扩散的影响较弱，往往可以 忽略。另外，在液相色谱中还存在比较显著的滞留流动相传质及柱外效应。【 16-4】 何谓化学键合相色谱、正相色谱和反相色谱？ 答：化学键合相色谱是指在化学键合固定相上进行物质分离的一种液相色谱法。 正相色谱是采用极性键和固定相流的相用比键合相极性小的非极性或弱极性有机溶剂。 反相色谱采用非极性键和固定相流的相为强极性的溶剂。【 16-5

4、】 何谓化学键合固定相？它的突出优点是什么？ 答：利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面形成的固定相称为化学键合固定相。优点 : 固定相表面没有液坑 ,比一般液体固定相传质快的多；无固定相流失 ,增加了色谱柱的稳定性及寿命； 可以键合不同的官能团 ,能灵活地改变选择性 ,可应用与多种色谱类型及样品的分析；有利 于梯度洗提 ,也有利于配用灵敏的检测器和馏分的收集。【 16-6】 什么叫梯度洗脱？它与气相色谱中的程序升温有何异同？ 答：梯度洗脱是指将两种或两种以上不同极性但可互溶的溶剂， 随着时间的改变而按一定比例混合。 以连续改变色谱柱中淋洗液的极性，离子强度或 pH 等，从而改变被测组分的

5、相对保留值、提高分 离效率、加快分离速度的一种洗脱方式。液相色谱中梯度淋洗和气象色谱中程序升温作用相同。不 同的是：在起诉相色谱中通过改变温度条件，达到高效快速分离目的；而液相色谱是通过 改变流动 相极性来达到目的。【 16-7】 指出下列各种色谱法中最适宜分离物质。（1）气液色谱；（2）正相色谱；（3）反相色谱；（4）离子交换色谱； （5）凝胶色谱；（6）气固色谱；（7）液固色谱。答：（ 1）气液色谱：适宜分离气体或易挥发性液体和固体。（或可转化为易挥发性液体和固体。 ）（2）正相色谱：适宜分离极性化合物。（3）反相色谱：适宜分离多环芳烃等低极性化合物。（4）离子交换色谱：适宜分离离子型和可

6、离解化合物。（ 5）凝胶色谱：适宜分离大分子化合物， （分子量 >2000 ） 例蛋白质、氨基酸、核酸等生物大 分子。（6）气固色谱：适宜分离永久性气体及烃类化合物。（ 7）液固色谱：适宜分离不同极性的化合物，或不同类型的化合物，特别适合分离异构体。【16-8】 指出下列化合物被液体流动相从氧化铝柱中洗脱的峰序：正丁醇、 1-丁基氯、 正己酸、正己烷、 2-己烯。答：正己烷， 2-己烯， 1-丁基氯，正丁醇，正己酸。【 16-9】 指出下列化合物从氧化钙柱中流出的顺序：正丁醇、甲醇、正己醇、乙醇。 答：甲醇，乙醇，正丁醇，正己醇。【 16-10】 指出下列物质在正相色谱中的洗脱顺序。（1

7、）正己烷，正己醇，苯；（2）乙酸乙酯，乙醚，硝基丁烷。答：（ 1）正己烷，苯，正己醇 （ 2）乙醚，硝基丁烷，乙酸乙酯【 16-11】 指出习题 10 中物质在反相色谱中的洗脱顺序。答：（ 1）正己醇，苯，正己烷 （ 2）乙酸乙酯，硝基丁烷，乙醚【16-12】 指出下列离子从阴离子交换柱中流出的顺序：Cl-，I-， F-，Br-。答： F-， Cl -， Br-，I-。【16-13】 预测下列离子从阳离子交换柱中流出的可能顺序：Ca2+，Ba2+，Mg2+，Be2+， Sr2+。答：Be2+, Mg2+, Ca2+, Sr2+, Ba2+。【16-14】相对分子质量约为 120000的蛋白质在

8、1根排阻极限为 80000的凝胶柱上的保留体积为15mL，萘(MW128)在同1根柱上的保留体积为 124mL，某特定试样组分的保留体积为87mL。假定萘的相对分子质量小于凝胶的渗透极限，计算总孔容积和试样组分的分配系数。答：109mL，0.66【16-15】用1根以二甲基甲酰胺作为流动相的排阻色谱柱检测聚氧化乙烯的保留体积，试利用表中结果估计保留体积为13.5mL的聚氧化乙烯聚合物的相对分子质量。相对分子质量V/mL相对分子质量V/mL1.1 X0317.27.7 10414.15.1 10316.37.0 10512.72.0 10415.1解：以相对分子量 Mr取对数logMr作为纵坐标

9、以保留体积 V为横坐标，求出斜率 Klg5.1 103- lg1.1 104 (16.317.2)©K10.744lg7.7 104 lg2.0 104(14.1 4.3)K2K2 0.57K 0.6572保留体积为13.5mL的相对分子质量lg7.0105 lg Mr 0.657(12.713.5)5解得 Mr 2.110【16-16】为了解决下列分析课题，可否采用色谱法(应指出其具体的方法名称)？若不能采用，应当用哪些方法较为合理？(1) 液体中的烯烃、炔烃和芳烃三族物质的分类和分析；(2) 水溶液中甲酸、乙酸、丙酸和丁酸的总酸度的测定；(3) 甲酸、乙酸、丙酸和丁酸混合物中含量

10、的分别测定；(4) 某工厂临时购得一批乙醇原料，其中含丙酮约为5%10%，要求比较准确测出原料中丙酮 的含量；(5) 混合物中对、间、邻二甲苯含量的分别测定；(6) 鉴定某一商品高聚物；(7) 生物化学制品，如蛋白质、胆汁酸的分类分析；(8) 空气中氟化氢、二氧化硫气体的分析；(9) 氯化钾和氯化钠水溶液中两种正离子含量的分别测定；(10) 钢铁中为了 2、02、H2的测定。【16-17】 欲测定下列试样，采用哪种色谱法较为适宜？并指出所选用的固定相、流动相和检 测器。(1)(蒽)和(菲)；(2) CH3CH2OH 和 CH3CH2CH2OH ；(3) Ba2+和 Sr2+ ；(4) C4H9

11、COOH 和 C5H11COOH ；(5) 高相对分子质量的葡糖苷；(6) 苯和丁酮；(7) 丁酮和乙醇；(8) 正己烷、正庚烷、正辛烷和正癸烷;(9) 分析苯中微量水分；(10) 苯乙酮、苯、硝基苯;(11)(12)O H、COOC2H(13) F-、Cl-、Br-、NO3-；(14)乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸;(15)OHOHCH3(16) N2 和 02；(17 )邻二甲苯、间二甲苯和对二甲苯。解：部分答案如下表:题号方法名称固定相流动相检测器(6)气相色谱高分子多孔微球氢气热导池检测器(7)气相色谱QF-1氮气氢火焰离子化检测器(8)气相色谱SE-30氮气氢火

12、焰离子化检测器题号方法名称固定相流动相检测器(9)气相色谱高分子多孔微球氢气热导池检测器(10)气相色谱邻苯二甲酸二壬酯氮气氢火焰离子化检测器(11)反相液-液色谱ODS-permaphase甲醇冰紫外检测器(12)液固吸附色谱法多孔硅胶甲醇/正己烷紫外检测器(13)离子交换色谱离子交换树脂缓冲液电导检测器(14)气相色谱法硅油(SF-1000)氮气氢火焰离子化检测器(15)液固吸附色谱法Al 2O3CH2CI2/正己烷紫外检测器(16)气相色谱法分子筛氦气热导池检测器(17)气相色谱法邻苯二甲酸二壬酯氢气热导池检测器【16-18】电渗流是如何产生的？讨论电渗流在毛细管电泳分类中的意义。答：电

13、渗现象中整体移动着的液体称为电渗流。HPCE中通常使用石英作为毛细管材料，石英的等电点约为1.5，因此在常用缓冲溶液中（pH > 3），管壁带负电，石英毛细管表面的硅羟基（三SiOH）电离为硅氧基负离子（三S©，并将溶液中水合离子（一般为阳离子）吸附到毛细管表面附近，形成双电 层。当在毛细管两端加电压时，双电层中的阳离子向阴极移动，由于离子是溶剂化的，所以带动了 毛细管中整体溶液向阴极移动，形成电渗流（EOF）。电渗流在电泳分离过程中的有重要意义。体现在：使混合物中的正、负离子和中性分子产生差速迁移而实现分离；通过 EOF的大小和方向的控制，可以提高CE的分离效率、选择性和分离

14、度。【16-19】毛细管电泳有哪些主要分离模式？答：（1）毛细管区带电泳（CZE）将待分析溶液引入毛细管进样一端，施加直流电压后，各组分按各自的电泳流和电渗流的矢量和流向毛细管出口端，按阳离子、中性粒子和阴离子及其电荷大小的顺序通过检测器。中性组分彼此不能分离。出峰时间称为迁移时间（tm），相当于高效液相色谱和气相色谱中的保留时间。（2）毛细管凝胶电泳（CGE）在毛细管中装入单体和引发剂引发聚合反应生成凝胶，这种方法 主要用于分析蛋白质、DNA等生物大分子。另外还可以利用聚合物溶液，如葡聚糖等的筛分作用进 行分析，称为毛细管无胶筛分。有时将它们统称为毛细管筛分电泳，下分为凝胶电泳和无胶筛分两类

15、。（3）毛细管等速电泳（CITP ）采用前导电解质和尾随电解质，在毛细管中充入前导电解质后， 进样，电极槽中换用尾随电解质进行电泳分析，带不同电荷的组分迁移至各个狭窄的区带，然后依次通过检测器。（4） 毛细管等电聚焦电泳 （CIEF）将毛细管内壁涂覆聚合物减小电渗流，再将样品和两性电解 质混合进样，两个电极槽中分别加入酸液和碱液，施加电压后毛细管中的操作电解质溶液逐渐形成pH 梯度，各溶质在毛细管中迁移至各自等电点(pI )时变为中性形成聚焦的区带，而后用压力或改变检测器末端电极槽储液的 pH 值的办法使溶质通过检测器。(5) 胶束电动毛细管色谱( MEKC 或 MECC )当操作缓冲液中加入

16、大于其临界胶束浓度的离 子型表面活性剂时表面活性剂就聚集形成胶束，其亲水端朝外憎水非极性核朝内，溶质则在水和胶 束两相间分配，各溶质因分配系数存在差别而被分离。 。(6) 毛细管电色谱(CEC)将细粒径固定相填充到毛细管中或在毛细管内壁涂覆固定相以电渗 流驱动操作缓冲液(有时再加辅助压力)进行分离。【16-20】 试比较毛细管电泳与高效液相色谱方法。高效毛细管电泳仪(HPCE )是以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，禾U用荷电粒子 之间的淌度差异和分配系数差异进行分离， 是分析科学继高效液相色谱仪 ( HPLC )之后的又一重大 进展，使分析科学从微升级进入到了纳升级水平，不仅使单细胞

17、乃至单分子分析成为可能，也使蛋 白质和核酸等生物大分子分析有了新的转机。 HPCE 与 HPLC 比较如下：一、相同点：1、检测器： HPCE 和 HPLC 均可采用紫外检测器、 荧光检测器和电化学检测器等。 但由于 HPCE采用在柱检测，光路短，灵敏度和线性范围都不如HPLC。2、定性和定量方法： HPCE 的定性和定量方法与 HPLC 相同，采用出峰时间定性，峰面积或峰 高定量。3、柱效和分辨率： HPCE 的柱效和分辨率计算方法与 HPLC 相同。二、不同点：1、分离原理：(1) HPCE :基于组分在载体电解质中迁移速度的不同。(2) HPLC ：基于组分在固定相和流动相之间分配系数的

18、不同。2、分离模式：(1) HPCE :毛细管区带电泳、毛细管胶束电动色谱、毛细管凝胶电泳、毛细管等电聚焦电泳 和毛细管等速电泳等。(2) HPLC :正相色谱、反相色谱、离子交换色谱和凝胶色谱等。3、分离柱：(1) HPCE :小内径毛细管柱内装不同载体电解质。(2) HPLC :小内径毛细管柱内装不同固定相。4、进样方式:(1) HPCE :电动进样、压力进样和扩散进样。( 2) HPLC :微量注射器进样、六通阀进样和自动进样器进样。5、进样体积：（1）HPCE:纳升级。（2）HPLC :微升级。6、溶质驱动方式:（1）HPCE :以高压直流电场为驱动力。（2）HPLC :以高压输液泵驱动流动相。7、采用毛细管的目的:（1）HPCE :有