细菌鉴定方法

1、一淀粉水解试验（一）实验原理细菌对大分子的淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须靠产生的胞外酶，如 淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶将大分子物质分解。胞外酶能分泌扩散到细胞外，将 物质分解成小单位如糖、氨基酸、甘油与脂肪酸。这些小单位的物质能被细菌 吸收和利用。水解过程可通过底物的变化来证明，如细菌水解淀粉的区域，用 碘测定不再产生蓝色；水解明胶可观察到明胶被液化；脂肪水解后产生脂肪酸 改变培养基的pH,其中的中性红指示剂使培养基从淡红色变为深红色。（二）实验方法将淀粉培养基溶化后，冷至 45 c左右，以无菌操作制成平板。取18-24h的纯培养物点于平板上，每皿可点种 3-5个菌株，适温培养2-4d, 形

2、成菌落后，在平板上滴加卢戈氏碘液，以铺满菌落周围为度，平板成蓝色。如果菌落周围有无色透明圈出现，说明淀粉已经被水解，实验为阳性，否则为 阴性。透明圈的大小一般说明水解淀粉的能力。（三）实验试剂的配制肉汤蛋白陈琼脂成分：蛋白陈10g,牛肉膏3g,氯化钠5g,琼脂17g,蒸储水 1000mL, pH7.2。淀粉培养基制法：在肉汤蛋白陈琼脂中添加0.2%的可溶性淀粉，校正 pH值至7.6,分装三角瓶，121c 20min灭菌备用。卢戈氏（Lugol）碘液：碘片1g,碘化钾2g,蒸储水300ml,先将碘化钾溶解在 少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，混匀，定容。二糖发酵试验（一）实验原理单糖发酵是将

3、葡萄糖，乳糖或麦芽糖等分别加入蛋白陈水培养基内，使其最终 浓度为0.75-1 %。并加入一定量酚红指示剂及小倒管，制成单糖发酵管，接种 细菌经37 c培养18-24小时，若能分解糖产酸则酚红指示剂由红变黄，若能分 解甲酸有CO2和H2等气体形成，小倒管内则聚集有气泡；不分解，则指示剂 不变色。（二）实验材料1 .菌种：大肠杆菌，伤寒杆菌 18-24小时琼脂斜面培养物。2 .培养基：葡萄糖发酵管，乳糖发酵管等。（三）实验方法1 .将伤寒杆菌，大肠杆菌按照液体接种方法分别接种于葡萄糖及乳糖发酵管内。2 .置37c孵箱培养18-24小时。3 .观察结果：由于一些细菌能分解某种糖类产酸，所以培养基中p

4、H下降到7.0以下，在酚红指示剂的显示下，培养基颜色由红变黄。产酸者以“嘤示，如果同时产生气体，则培养基中小倒管内有气泡出现，此乃产酸又产气，以旷'表示，不分解，则指示剂不变色，用”表示。（四）实验结果伤寒杆菌大肠杆菌葡萄糖+乳糖-（五）实验试剂的配制1.单糖发酵管的制备：成分：蛋白陈水培养基100ml , 0.2%酚红1ml ,所需糖（葡萄糖或乳糖）0.75-1g制法：（1）将上述成分溶化，混匀分装于内含有倒置小玻璃管的小试管中，每管约2ml,加塞。（2）小倒管排气，灭菌（8-10磅，20-30分钟），贮存备用。用途：供单糖发酵试验用。2.0.2%酚红配制法酚红（phenol red

5、 ） 0.2g , 0.lmol/LNaOH 8ml ,蒸储水 92ml将酚红入研钵徐徐加入 0.lmol/LNaOH研磨，再补足蒸储水即成。若需长时间保存，可高压灭菌后贮存备用。三甲基红（M.R）试验（一）实验原理某些细菌如大肠杆菌等分解葡萄糖产生丙酮酸，继而分解为甲酸、乙酸、乳酸 等，使培养基pH值降至4.5以下，加入甲基红指示剂呈红色，此为阳性反应; 若产酸量少或产生的酸进一步转化为醇、醛、气体和水等，则培养基的酸碱度 仍在pH 6.2以上，加入甲基红指示剂呈现黄色，为阴性反应。（二）实验材料1 .菌种：大肠杆菌，产气杆菌 18-24h琼脂斜面培养物。2 .培养基：葡萄糖蛋白陈水培养基。

6、3 .试剂：甲基红试剂。（三）实验方法1 .分别将大肠杆菌，产气杆菌接种于两支葡萄糖蛋白陈水培养基中。2 .置37c培养2-3天取出，分别滴加甲基红试剂2-3滴，混匀，观察结果。（四）实验结果大肠杆菌：+,产气杆菌：-0（五）实验试剂的配制1 .甲基红试剂的配制甲基红 0.04g,95%酒精 60ml , 蒸储水 40ml。先使甲基红溶解于酒精中，再加入蒸储水，混合，摇匀即成。2 .葡萄糖蛋白陈水培养物成分：蛋白陈5g 葡萄糖5g制法：（1）将上述成分溶解于蒸储水中。（2）调节pH至7.6,用滤纸过滤除渣。（3）分装中试管，每管约 3-4ml,灭菌后备用。用途：供甲基红及 V-P试验用。四产呷

7、咪（indole）试验（一）实验原理某些细菌如大肠杆菌，变形杆菌等具有色氨酸酶，能分解蛋白陈水培养基中的色氨酸，产生靛基质（无色呷咪），再与欧立希试剂（对二甲基氨基苯甲醛）反应，形成红色化合物一玫瑰呷咪，即为阳性反应。（二）实验材料1 .菌种：大肠杆菌，伤寒杆菌 18-24小时琼脂斜面培养物。2 .培养基：蛋白陈水培养基。3 .试剂，欧立希（Ehrlich ）试剂（对二甲基氨基苯甲醛）（三）实验方法1 .分别将大肠杆菌，伤寒杆菌接种于两支蛋白陈水培养基中。2 .置37 c培养2-3天后,每管沿管壁各加欧立希试剂 0.5-1ml于培养液面上, 待1-2分钟后观察结果：在交界面出现玫瑰红色环即为呷

8、珠试验阳性，无红色 环即为阴性。（四）实验结果大肠杆菌：+ ；伤寒杆菌：-0（五）实验试剂的配制1 .蛋白陈水培养基的制备成分：蛋白冻10g 氯化钠5g 蒸储水1000ml制法：（1）先用少量蒸储水将蛋白陈和氯化钠相混合溶解，再加足蒸储水量。（2）调节pH至7.6、用滤纸过滤。（3）分装中试管，每管约 3-4ml,加塞灭菌后备用。2.欧立希（Ehrlich ）试剂的配制对位二甲基氨基苯甲醛 4g 95%酒精 380ml浓硫酸或浓盐酸80ml三种成分混合即成，瓶口要严密，以免挥发。五硝酸盐还原试验（一）硝酸盐还原试验原理：硝酸盐还原反应包括两个过程：一是在合成过程中，硝酸盐还原为亚硝酸盐和 氨，

9、再由氨转化为氨基酸和细胞内其他含氮化合物；二是在分解代谢过程中， 硝酸盐或亚硝酸盐代替氧作为呼吸酶系统中的终末受氢体。能使硝酸盐还原的 细菌从硝酸盐中获得氧而形成亚硝酸盐和其他还原性产物。但硝酸盐还原的过 程因细菌不同而异，有的细菌仅使硝酸盐还原为亚硝酸盐，如大肠埃希菌；有 的细菌则可使其还原为亚硝酸盐和离子态的钱；有的细菌能使硝酸盐或亚硝酸 盐还原为氮，如假单胞菌等。硝酸盐还原试验系测定还原过程中所产生的亚硝 酸盐。（二）培养基：硝酸盐培养基。（三）试剂：甲液（对氨基苯磺酸 0.8g+5mol/L醋酸100ml）;乙液（a-奈胺0.5g + 5mol/L 醋酸 100ml）。（四）方法：被检

10、菌接种于硝酸盐培养基中，于35c培养14d。将甲、乙液等量混合后（约0.1ml）加入培养基内，立即观察结果。（五）结果：出现红色为阳性。若加入试剂后无颜色反应，可能是：硝酸盐没有被还原，试验阴性；硝酸盐被还原为氨和氮等其他产物而导致假阴性结果，这时应在试管内加入少许锌粉，如出现红色则表明试验确实为阴性。若仍不产生红色， 表示试验为假阴性。若要检查是否有氮气产生，可在培养基管内加一小倒管，如有气泡产生，表示 有氮气生成。（六）应用：本试验在细菌鉴定中广泛应用。肠杆菌科细菌均能还原硝酸盐为亚硝酸盐；铜 绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌等假单胞菌可产生氮气；有些厌氧菌如韦荣球 菌等试验也为阳性。（七）实

11、验试剂的配制硝酸盐液体培养基蛋白陈5.0g, KNO3 0.2g,蒸储水1000 mL , pH7.4 ,每管分装4-5mL, 121c 灭菌 15-20min 。六产氨实验（尿素分解实验）（一）实验原理某些细菌如变形杆菌，具有尿素分解酶，能分解尿素而产生氨，氨溶于水变成氢氧化钱，使培养基变碱而呈红色即为阳性。（二）实验材料1 .菌种：变形杆菌，伤寒杆菌 18-24小时琼脂斜面培养物。2 .培养基：尿素培养基。（三）实验方法1 .分别以斜面接种法将变形杆菌，伤寒杆菌接种于两支尿素斜面培养基上。2 .置37 c培养18-24小时。3 .取出观察结果，培养基变为红色，即尿素分解试验阳性，若不变色，

12、即为尿 素分解试验阴性。（四）实验结果变形杆菌：+ ；伤寒杆菌：-0（五）实验试剂的配制1 .尿素培养基的制备成分：蛋白陈1g、氯化钠5g、葡萄糖1g、蒸储水900ml、琼脂15-20g、0.1%酚红 12ml、20%尿素水溶液（无菌）100ml。制法：（1）除尿素、琼脂和酚红外，其余成分溶于水中，加热溶化，矫正 pH 至 6.8-6.9。（2）加入琼脂和酚红，115c磅灭菌10min。（3）冷却至60 c后加入无菌尿素溶液，摇匀。（4）分装中试管（无菌），每管 3-4ml,置成斜面备用。说明：（1）尿素不耐热，也不能久存，只能用滤器除菌。2.无菌尿素溶液制备：称取尿素 20g,混合于100m

13、l蒸储水中，充分摇匀，用 G6滤菌器过滤除菌，以达到无菌的目的。七 柠檬酸盐利用试验（一）实验原理本试验用于检测细菌利用柠檬酸的能力。细菌利用柠檬酸盐的能力不同，如各 种肠细菌可利用柠檬酸为碳源，而大肠埃希氏菌则不利用柠檬酸盐。因此，能 否利用柠檬酸盐是一项鉴别性特征。培养基中含有柠檬酸钠时，如将柠檬酸分 解为CO2,则培养基中由于有游离钠离子呈碱性，使培养基中酚红指示剂 （pH6.8-8.4,黄-红）由淡粉红色变为玫瑰红色以识别之。（二）材料柠檬酸钠 2g、 K2HPO4 1g、 NH3H2PO4 1g 、 NaCl 5g、 MgSO4 0.2g 、琼月旨 1.5 2g、1%澳麝香草酚蓝（酒

14、精溶液）或0.04%苯酚红10ml、水1000ml 将上述各成分加热溶解后，调 PH6.8,然后加入酚红指示剂，摇匀，用脱脂棉 过滤。制成后为黄绿色，分装试管。121c灭菌20min后制成斜面。（三）实验内容1 .将试验菌在斜面上划线接种，适温培养 3-5天。2 .若该菌能利用柠檬酸盐，则可在此斜面上生长并将培养基由原来的淡粉红色 变为玫瑰红色，此为阳性；颜色不变者为阴性。八油脂水解试验（一）原理某些细菌能够分泌脂肪酶（胞外酶），能将培养基中的脂肪水解为甘油和脂肪酸。所产生的脂肪酸，可通过预先加入油脂培养基中的中性红加以指示指示范围pH6.8 （红）pH8.0 （黄）。当细菌分解脂肪产生脂肪酸时，培养基中出 现红色斑点。（二）实验内容1 .将装有油脂培养基的锥形瓶置于沸