猪瘟的临床诊断

1、猪瘟的临床诊断与实验室诊断猪瘟（classical swine fever，CSF），又称“烂肠瘟”，是由猪瘟病毒引起的猪的一种热性、致死性、高度接触性传染病，对养猪业影响颇大。1984年，国际兽疫局（OIE）将其列入A类传染病，我国目前将其定为一类传染病。 根据多年的流行病学研究和文献资料表明，大、中型养猪场通过科学而有效的免疫接种程序所建立的猪群，在猪瘟流行时只引起猪瘟的散发。尽管实行科学的防疫制度，包括疫苗提高药量，但没有完全扑杀带毒猪，某些养猪场就成为猪瘟的疫源地。因此，要不断地学习和研究预防猪瘟科学的措施、方法，主要环节是提高防疫措施、诊断、接种后的免疫预防和评价。对此，养猪场迫切需

2、要及时诊断猪瘟和定期检疫猪瘟，只有快速、灵敏、准确、便捷的临床与实验室诊断，有利于有效地控制和扑灭猪瘟，从而保护养猪业。 1 临床诊断 猪体温变化明显，迅速上升到41，少数达到42，稽留不退。食欲不振，其特征为病猪把嘴放在食物处片刻，又回到休息处。精神萎顿，伏卧嗜睡，后肢无力。先便秘后腹泻，以后交替发生，粪便中混有粘液或血丝。后期部分病猪有尿血、气喘等症状。急性结膜炎流出粘液或脓性分泌物，有些上、下眼睑粘在一起。常在鼻端、耳、四肢内侧、腹下有出血斑和出血点，指压不褪色。个别猪有神经症状：磨牙、痉挛、脚交叉、站立不稳。先天性猪瘟病毒感染可造成流产、木乃伊胎、畸形、死胎、有震颤症状的弱仔猪出生、或

3、外观正常但生产出被感染的仔猪。 全身性出血，皮肤、粘膜、实质器官都有充血和大小不等的出血点。淋巴结外观充血肿胀，切面周边出血，呈红白相间的“大理石样”。脾脏不肿大，边缘发现楔状梗死区。肾皮质色泽变淡，有点状出血。膀胱粘膜表现不同程度的充血，粘膜上有针尖大小的出血点。扁桃体出现梗死，随着细菌侵入发生化脓性炎症。肠道有不同程度的充血和出血，回盲瓣、回肠、结肠可见轮层状溃疡即“扣状肿”。公猪包皮积尿。 根据以上临床症状、特征性病理变化，可以建立猪瘟的初步诊断，但应与猪丹毒、猪副伤寒、猪肺疫、猪弓形体和链球菌病等进行鉴别。 2 实验室诊断 根据临床症状、特征性病理变化，建立猪瘟的初步诊断，但确诊、非典

4、型猪瘟，特别是仔猪表现的复杂症状，难以做出诊断，必须借助实验室诊断进行确诊，现在实验室诊断应用方法有动物试验、病毒分离、免疫荧光试验等。 2.1 动物试验 取病猪的扁桃体、脾脏、肾脏、淋巴结等组织（扁桃体是分离病毒首选器官，如采集不到扁桃体，也可采集脾脏、肾脏、淋巴结），剪碎、研磨，加生理盐水制成乳剂，无菌处理后接种易感猪，观察发病情况，然后分离病毒。中国兽医药品监察所建立用家兔代替易感猪诊断猪瘟试验（兔体免疫交叉试验），将病料乳剂接种健康家兔，7d用兔化猪瘟弱毒注射家兔，24h后每6h测温1次，连续3d。无定型热反应，说明病料中含有猪瘟病毒。 2.2 病毒分离 取病猪的扁桃体、脾脏、肾脏、淋

5、巴结组织，加双抗后磨成乳剂，过滤、离心后取上清液，接种PK-15、PK-2a、ST等细胞进行病毒分离。Moormann等用SK-6细胞培养克隆化的猪瘟病毒，获得高效价的猪瘟病毒，并提取猪瘟病毒的RNA，建立猪瘟病毒的cDNA文库，完成Alfort株、Brescia株的全基因序列分析。 2.3 免疫荧光试验 用冰冻切片或细胞触压片进行直接或间接荧光抗体染色，也可先将病料乳剂接种于细胞培养后，再用荧光抗体检测感染细胞，能直接检出感染细胞中的病毒抗原。此法方便快速、检出率高，许多国家将它作为执行猪瘟消灭计划的法定诊断试验。 2.4 血清中和试验 可以检测出猪体内的抗体，目前最常用方法是免疫荧光中和试

6、验、PAV株中和试验。邵振华等利用免疫荧光中和试验，对70日龄65份、56日龄34份、7月龄44份的猪瘟非免疫血清进行猪瘟母源抗体检测，结果70日龄阳性率52.3%，到56月龄全部转为阴性。 2.5 间接血凝试验 操作简单，易制定，既可检测抗原，也可检测抗体，主要是监测猪瘟免疫抗体水平。李树春等将猪瘟兔化弱毒株细胞培养物浓缩纯化，致敏由戊二醛鞣酸处理的健康绵羊红细胞，制成冻干猪瘟间接血凝诊断液，用以检测血清中的猪瘟抗体效价。 2.6 骨髓细胞学检查法 病初取病猪胸骨的骨髓浆汁做成涂片，姬姆萨染色后镜检，出现副淋巴母细胞，确定病猪感染猪瘟病毒。 2.7 酶联免疫吸附试验（ELISA） 酶免疫分析

7、技术是继荧光技术后发展起来又一先进诊断技术，其基本原理是特异性反应系统、间接放大系统和显示系统结合起来，用于检测抗体或抗原的一种免疫方法。Shannon等报道，在猪瘟感染前病毒血症产生时，采其血清进行ELISA检测猪瘟病毒，可做早期诊断，捕获ELISA能够检测2种不同猪瘟病毒株感染的病猪的血液和组织中的抗体。 2.8 核酸探针杂交试验 核酸探针技术以病毒RNA基因组为模板制备探针，在cDNA合成后进行Southern-blotting。这种方法特异性强、准确可靠，可用于不同毒株的分离和鉴定。Cruliere等、Dable等、Colijin等利用猪瘟病毒基因组RNA构建cDNA，与牛病毒性腹泻病

8、毒进行序列分析，合成36个探针，按照它们在病毒基因组的位置，根据特异杂交带区别猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒以及绵羊边界病病毒。 2.9 反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR） 是以病毒RNA为模板进行反转录，再以PCR进行核酸扩增来检测猪瘟病毒。罗廷荣等应用RT-PCR对猪瘟诊断表明，RT-PCR技术可应用于临床诊断。Sand-Vik等和Glodrick等分别利用此法对猪瘟病毒进行检测，结果显示此法具有检出率高、特异性强，微量病料即可诊断，且具有生物安全性，无散毒的危险。 实验室诊断方法介绍如下：    (一)动物接种  检测猪瘟病毒的敏感方法，应用易感的

9、幼龄猪(1020kg体重)进行接种试验。取病料或新鲜猪尸的血液或组织乳剂，肌肉注射接种12头幼猪。试验猪应事先进行血清中和试验，以排除有过猪瘟病毒或牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的感染。如果幼猪在接种后67天停食或体温升高，则立即采血分离病毒。幼猪发病死亡后，立即采取扁桃体、脾脏、淋巴结、肾脏等做病毒分离。如果幼猪在接种后21天不发病或发病后康复，则采血测定血清的中和抗体效价，并用强毒进行攻毒试验。从血液或组织中可分离到猪瘟病毒，被接种的幼猪产生中和抗体，对强毒攻击表现免疫性，即可判为阳性。相反，幼猪不发病，不产生中和抗体，对强毒攻击有易感性，则判为阴性。如果幼猪发病或死亡，但未分离出猪瘟病毒也

10、不产生中和抗体，则应考虑其他病原感染的可能性。由于普遍存在低毒力的病毒株，所以被接种幼猪即使不呈现猪瘟症状，也应进行血液中的病毒分离试验。        (二)免疫荧光试验  主要用于检测病毒抗原，是目前国内外实验室诊断猪瘟的最常用方法，结果直观、可靠。特别是在疫情初起必须查清病原、检疫及以猪场猪瘟净化时，此种检测方法尤为重要。    进行免疫荧光试验时，将待检病猪的扁桃体、肾脏、淋巴结、脾脏等组织的冰冻切片或抹片，或待检细胞培养片，经丙酮固定后，滴加猪瘟荧光抗体覆盖于切片、抹片或细胞片表面，置

11、37作用30min，然后用磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.2，0.01mol/L)洗涤，自然干燥后置荧光显微镜下观察。必要时，设立抑制试验染色片，以鉴定荧光的特异性。在荧光显微镜下，见切片、抹片或细胞培养物(细胞盖片)中有胞浆荧光，并由抑制试验证明为特异性荧光，判为猪瘟阳性反应；无荧光判为阴性反应。    必须指出，牛病毒性腹泻病病毒与猪瘟存在共同抗原性，因此，牛病毒性腹泻病病毒也能结合猪瘟荧光抗体。但因牛病毒性腹泻病病毒对猪并无明显的病原性，也不能在猪体内充分增殖，因此不至于干扰诊断结果，且因牛病毒性腹泻病病毒可在细胞培养物上引起细胞病变，鉴定并不困难。 

12、;   (三)中和试验  血清中和试验可以检出动物体内的抗体，但因推广应用弱毒疫苗，猪群中的猪瘟抗体滴度普遍较高，故应进行双份血清的检查(前后期相差14天以上)，才能确立抗体滴度增高与感染患病的关系。    目前最常应用的血清中和试验方法是免疫荧光中和试验，即用定量病毒加不同稀释度的被检血清进行试验。同时以SPF猪血清作为阴性对照，以猪瘟高免血清作为阳性对照。所有试验血清均经56灭活30min后，按下列步骤进行：用含0.5乳白蛋白水解物和0.025mol/L的MgCl2•6H2O(即每1000mL中含有5.07g)

13、的Earle氏液稀释病毒和被检血清。被检血清按4倍连续稀释法稀释，由1:4至1:1024。取不同稀释度的血清分别和等量病毒液混合，置37感作1h，随后接种飞片上的PK-15细胞培养物。同时设置各种对照组。再培养1824h，取出后做免疫荧光抗体检查。计数各飞片中荧光细胞灶的数目。与对照组相比较，凡能减少90荧光细胞灶的血清稀释度就是该血清的终点滴度。1:4血清组的荧光细胞灶减少不到90者，判为阴性。    (四)琼脂扩散试验  虽可选用病猪的脾、淋巴结和肠段为病料制备抗原，但以胰腺最好。另需要具备特异性好的猪瘟高免血清。本法操作简单，但敏感性较低，肯定是猪

14、瘟病例的阳性检出率也低于50。欧洲一些国家，如英国的某些诊断实验室专门制备高价免疫血清和抗原，并有统一的判定标准。    用pH8.6的巴比妥缓冲液配制1.2琼脂，内加万分之一柳硫汞防腐。按中央1孔，周围6孔的模式打孔。孔径5mm，孔间距6mm。检测抗原时，将高免血清滴人中央孔内，周围孔内分别滴加标准抗原和待检病料乳剂。检测抗体时，将标准抗原滴人中央孔内，周围孔上、下2孔内滴加高免血清，其他4孔分别滴加被检血清。    (五)新城疫病毒强化法  在一定条件下，先被猪瘟病毒感染的猪睾丸的细胞，在随后再感染新城疫病毒时，可以产生

15、细胞病变。这一现象被用来检测猪瘟病毒，称为新城疫病毒强化法，简称END(Exaltation of NDV)。直接法END(将被检病料直接接种细胞培养物)的敏感性较低，但如改用两步法，即先将被检材料接种猪脾细胞培养物，传代适应之后再做END试验，则可明显提高其敏感性，几乎能与易感猪接种法等同。具体做法是在猪睾丸细胞培养物中接种被检材料(HCV)，37培养4天，随后接种106个蚀斑形成单位的新城疫病毒，继续培养3天。根据是否出现细胞病变进行判定。同时设对照组。如果细胞培养物出现病变，即表示有猪瘟病毒存在。END法适用于检测那些易在猪源细胞中生长的野外毒株，对大部分兔化弱毒株无效，因其往往不能在猪

16、睾丸细胞内充分增殖。    (六)酶标记抗体诊断法  先用PK-15细胞增殖HCV作为抗原，包被微量滴定板，随后加入被检血清(第一抗体)，冲洗后再加入酶标记的兔抗猪IgG，再经冲洗，最后加入底物显色，判定结果。由于我国养猪业普遍实施猪瘟兔化弱毒疫苗预防注射，猪血清中几乎都含有猪瘟抗体，给酶标抗体诊断法带来一定的困难。所以，许多兽医诊断室将该法只作为猪瘟免疫监测的一种手段。    (七)单克隆抗体鉴别诊断  由于瘟病毒属病毒之间存在共同的抗原性，血清学上产生交叉反应。在田间，猪不但可感染猪瘟，也可感染BVDV，而且猪感染后者之后产生病毒血症，随后产生抗猪瘟的中