叶绿素的测定分光光度法

1、XX行业标准xx的测定(分光光度法)S L 881994Determination of chlorophyll(Spectrophotometric method)水利部1995/ 05/01批准1995/05/01实施1总则1.1 主题内容本标准规定了用分光光度法测定水体中的叶绿素。1.2 适用范围本标准适用于河流、湖泊、水库或池塘等水体中叶绿素的测定。1.3 干扰及消除1.3.1 脱镁叶绿素a能够干扰叶绿素a的测定，当含有脱镁叶绿素时叶绿素a的测定值偏高。因此，在测定叶绿素a的时候，还要测定脱镁叶绿素a1.3.2 脱镁叶绿素a对叶绿素a的干扰，可通过测定叶绿素a酸化前后产生 的吸收峰之比

2、，对表观叶绿素a的浓度作脱镁叶绿素a的校正。2原理将一定量的试样用微孔滤膜过滤，收集植物性浮游生物，用90%勺丙酮溶液提取。将提取液离心分离后，测定750、 663、645、630nm的吸光度，计算叶绿素的浓度。3仪器3.1 分光光度计。3.2 比色 xx: 10mm和 50mm。3.3 医用离心机。3.4 离心管：1015mL带塞刻度管。3.5 研钵：直径约80mm。3.6 过滤装置：过滤器，微孔滤膜（孔径 0.45因1,直径60mm）,真空泵（吸气泵或蠕 动泵）。3.7 常用实验设备。4试齐I4.1 碳酸镁悬浮液：1% （m/V）。称取1.0g细粉末碳酸镁（Mg CO3）悬浮于100mL蒸

3、储水中。每次使用时，要充分摇匀。4.2 丙酮溶液：90%（v/V）。在900mL丙酮中加100mL蒸储水。4.3 盐酸溶液：1mo 1/L。量取83mL盐酸（p= 1.19g/mL）溶于水 中，冷却并稀释至1000mL。4.4 的采集与保存5.1 样品应按浮游植物定量采样方法，采集在玻璃或聚乙烯瓶子里。河流、 湖泊、水库取500mL,池塘取300mL。5.2 采样后，样品应放在荫凉处，避免日光直射，最好立即对水样进行分析 处理。如需放置水样，则应避光冷藏保存（25C）,而且每升水样需加1mL 1%碳酸镁悬浮液，以防止酸化引起色素溶解。6步骤6.1 浓缩：在一定量的试样中添加0.2mL碳酸镁悬浮

4、液，充分搅匀后，用直径 60mm 的微孔滤膜吸滤。过滤器内无水分后，还要继续抽吸几分钟。如果要延时提取，可把载有浓缩样品的滤膜放在干燥器里冷冻避光贮存。6.2 提取：将载有浓缩样品的滤膜放入研钵中，加入 3mL丙酮溶液（4.2）至滤纸浸 湿的程度，把滤膜研碎，再少量地加 90%的丙酮溶液，把滤膜完全研碎，然后 用90%丙酮溶液将已磨碎的滤膜和丙酮溶液洗入带刻度的带塞离心管中，使离 心管内提取液的总体积不超过 6mL,盖上管塞，置于4c的暗处浸泡24 h。6.3 离心：将离心管放入离心机中，以 4000 r /m i n速度离心分离 20m i n。将上 清液移入标定过的10mL具塞刻度管中，加

5、少量90%丙酮溶液于原提取液的离 心管中，再次悬浮沉淀物并离心，合并上清液。此操作重复23次，直至沉淀不含色素为止，最后将上清液定容至 10mL。6.4 测定：取上清液于10mm或50mm的比色池中，以90%丙酮溶液为对照溶液，读 取波长750, 663, 645和630nm的吸光度。选择比色池的光程长度或稀释 度，使其光密度OD663大于0.2,小于1.0。7结果表示从各波长的吸光度中减去波长 750 nm的吸光度，作为已校正过的吸光度 D,按下式计算叶绿素的浓度：8注意事项8.1 使用的玻璃器皿和比色皿均应清洁、干燥、无酸，不要用酸浸泡或洗8.2750 n m处的吸光度读数用来校正混浊度。由于在 750nm的提取液的吸 光度对丙酮与水之比的变化非常敏感，因此对于丙酮提取液的配制要严格遵守 90份丙酮比10份水（体积比）的配比。8.3 使用斜头离心机时，容易产生二次悬浮沉淀物。为了减少这一困难，使 用外旋式离心机头，在离心之前瞬间加入过量的碳酸镁。8.4 在研钵中用90%丙酮溶液提取叶绿素时，如果研磨操作进行不充分，就 不能完全提取出来。也可以用外筒玻璃代替研钵，研棒用特氟隆制的匀化器。8.5 因为叶绿素提取液对光敏感，故提取操作等要尽量在微弱的光照下进 行。8.6 吸收池事先要用90%丙酮溶