大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法

1、大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法感受态细胞(Competent cells) ：常态的细胞不能摄入外部溶液中的DNA，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。 转化：是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。 进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限

2、制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。 -互补现象：因为许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型-半乳糖苷酶实现基因内互补（-互补）。当这种载体转入可编码?半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基-D硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所以称这种现象为-互补现象。由互补产生的-半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在

3、载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNA片段时，会造成LacZ()基因的失活，破坏-互补作用，就不能产生具有活性的酶。所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。方法一：TSS方法制备感受态细菌（又称一步法）一、准备工作1、缓冲液1×TSS的配制事先配制1M的氯化镁：20.3g氯化镁(6分子水结晶)，定容于100ml去离子水后封装，不用灭菌。取干净的100ml 量筒和100ml 烧杯，用量筒量取100ml去离子水，加入至烧杯中，取 1 g 蛋白胨，0.5g 酵母抽提物，0.5g 氯化钠，10 g PEG(MW= 3350)，5ml DMSO，

4、5ml 的1 M氯化镁，溶解后用盐酸或者氢氧化钠调整pH为6.5，混匀后用0.22um 滤器过滤除菌。储存在4度，保质期约6个月。2、已划平板（或者用枪头沾取并稀释后涂布）并在培养箱中过夜培养的菌种Dh5，用于接种并振荡培养。两个锥形瓶，分别装有30 ml和50ml LB，灭菌后置于4冰箱备用。3、若干已灭菌的琼脂平板，一个未加抗生素，用于第二步的接种，其余做转化用。 二、感受态制备程序前一天晚上调单菌落至30 ml LB中过夜培养（12-16h），按1：100 比例将过夜培养的菌液（500ul）加入到新鲜的50 ml LB培养液中，于37 振荡培养至OD600约为0.4(培养时间2h4050

5、min)。冰浴30分钟后4度1000g离心10min，弃上清，收获细菌。加入原体积十分之一（这里为5 ml）的1× TSS 液(冰预冷)悬浮细胞，然后分装成100l/份，全部冰上操作，-80保存。三、转化取一管（100l）感受态细菌，（冻存细胞应置于冰上缓慢融化后立即使用）加入3-5l DNA（0.1100ng），轻轻混匀后冰浴30min。加入0.9ml含20mmol/L葡萄糖的LB培养液，37度150r/min温和振荡培养 60min，涂布，室温放置约20分钟后放于37度恒温培养箱过夜培养（17-20h）。方法二：CaCl2法细菌转化的方法多以Mendel和Higa（1970）的发

6、现为基础，其基本方法是用冰预冷的CaCl2或多种2价阳离子等处理细菌，使之进入感受态得以转化。 用CaCl2制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞，常用于成批制备感受态细菌。本法适用于大多数大肠杆菌菌株，且迅速、重复性好。1从37培养1620h的新鲜平板中挑取一个单菌落（如大肠杆菌DH5），或1ml新鲜的1620h过夜培养物，转到一个含有100mlLB培养基的1L或500ml烧瓶中。于37剧烈振摇培养约23h（旋转摇床200300r/min），每隔2030min测量OD600值0.4。 2在无菌条件下将细菌转移到一个，用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中，在冰上放置1020min。 3于4用Sorva

7、llGS2转头（或与其离心管相配的转头）以4000r/min离心10min，以回收细胞。 4倒出培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。5以10ml用冰预冷的0.1mMCaCl2重悬每份沉淀，放于冰上。6于4用SorvallGS3转头（或与其相应的转头）以4000r/min离心10min，以回收细胞。 7倒出培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。8每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1M CaCl2重悬每份沉定，此时，可以迅速将细胞分装成小份，液氮中冰冻，-70贮存备用。9用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200l转移到无菌的微量离心管中，每管加DNA

8、或连接反应混合物（体积10l，DNA50ng），轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30min。10将离心管放到预加温到40的循环水浴中的试管架上，放置90s2min，不要摇动试管。11快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却12min。12每离心管加800l SOC培养基，用水浴将培养基加温到37，然后将管转移到37摇床上，温育45min使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。13将适当体积（每个90mm平板可达200l）已转化的感受态细胞转移到含200mmol/l MgSO4和相应抗生素的SOB培养基上。14将平板置于室温至液体被吸收。15倒置平皿，于37培养，1216h后可出现菌落。方法三

9、： CAS super One-Step Competent Cell Preps Kit采用一种简单便捷的方法处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，便于质粒DNA的转化，可满足一般实验的要求。与CaCl2法相比具有多种优点：使用方便，只需一步即可完成感受态细胞的制备；转化效率略高于CaCl2法，一般可达106-108cfu/g，满足一般实验需要；感受态细胞制成后即可保存于-70，无须加入甘油，并且经长期保存活力无明显下降。 一、准备工作1 从液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌冻存菌，在LB平板上划线，37过夜至长出单菌落。挑形态饱满的单菌落2个，分别接种5ml LB培养基中，37，250rpm，过夜

10、培养。2 次日从5ml LB培养物吸取200l转入50ml LB培养基中（250ml 锥形瓶），37，250rpm培养2小时，此时OD600约0.40.5。二、感受态细胞的制备3 吸取1ml菌液到1.5ml离心管里，5000rpm离心5分钟，弃去上清。 4 加入100l预冷的Solution A，悬浮菌体，冰浴30分钟。 5 此时感受态细胞已经制成可立即使用或-70保存。 三、细胞转化6 在感受态细胞中加入100pg-10ng DNA，混匀，冰浴30分钟，然后42 1分钟热击，再次冰浴2 分钟。加入0.9 ml LB 培养基，20l Solution B，37，振荡培养1小时。7 取适当菌液（

11、100-200l）涂布相应抗性的平板。8 过夜培养约16个小时，数菌落数，计算转化率。补充说明： 1 所用器具一定要清洁。2 操作步骤2 中培养基的装量也是很重要的，建议装量不要高于此值：500ml 锥形瓶装100ml培养基，250ml锥形瓶装50ml培养基。3 在收获菌体前半小时还可以在培养基中加入20mM的MgCl2 ，效果会更好一些。4 为保证细胞处于对数生长期，培养后的菌体的OD值不要高于0.6。5 制备感受态细胞时所有操作尽量保证在冰上操作。6 细胞转化操作步骤6中也可以不必进行热击，冰浴后直接加入新鲜LB，简化操作 步骤，但转化效率低于热击方法，适用于对转化率要求不高的实验。 方法

12、四： CaCl2法1、取1%大肠杆菌E.coli接种于含2ml LB培养基的试管中，37振荡培养过夜。2、取0.1ml过夜培养物转种于含10ml LB培养基的三角瓶中，37振荡培养3h至OD600=0.3。 3、然后把培养物倒入1.5ml离心管中，冰浴10min。4、在4下以4000rpm离心5min，去上清液。5、把菌体悬浮于15m1冰冷的0.1M CaCl2溶液中，置冰上30min。6、然后再在4下以4000rpm离心10min，去上清液。7、将菌体悬浮于0.1ml CaCl2溶液中，冰浴放置4-12hr备用。 方法五：1、将1ml过夜培养的细菌（如DH5、TG1、TM101）接种于100

13、ml 2×YT培养于500ml三角瓶。于37刷烈振荡，通常200rpm培养的细菌密度约OD550=0.20.5(5×107cells/ml),需24h。2、将培养物放于冰上冷却10min，于4离心细菌培养物，10000rpm离心10min。3、弃除上清，将细菌悬浮于原始培养体积的一半（约50ml）的50mM CaCl2和10mm TrisHCl（pH8.0）无菌冰预冷液体中。4、将细菌悬浮放在冰上约5min，然后将悬浮物于4 10000/rpm离心10min。5、弃上清，悬浮细菌于原始培养体积的1/15的50mM CaCl2和10mM TrisHCl（pH8.0）无菌冷冻中

14、。此时的细胞是感受态细胞，即可用于转化。200l分装于无菌的1.5ml微量离心管中，贮存于-80冰箱中。 方法六：TSB法1、药品制备1M Mg2+ (1MMgSO4 和 1M MgCl2等体积混合)，用0.22um滤膜超滤除菌。TSB液（30mL/ 80mL菌液）（现配现用）： PEG33503gTryptone0.3gYeast extract0.15gNaCl0.3g以上 121, 15min 灭菌后，加入1MMg2+ 600uL , 以及DMSO 3mL。2、制备步骤（1）活化菌株 （2）挑单菌落培养于5mL的液体培养基中。（3）取液体培养物50uL于80mL的液体培养基中进行扩大培养

15、。（4）370C培养3-4小时，OD600在0.4-0.6。（5）离心，去上清。（6）加入20mLTSB，重悬。（7）离心，去上清。（8）加入10mL TSB，再加入15-20%的甘油，分装保存。注：整个操作过程均应在冰上进行；所用药品均需灭菌。3、转化程序（1）取出200l感受态细胞慢慢使其溶化，并立即放于冰上，加入DNA或连接反应混合物，DNA量通常50mg。用手指弹打试管10次，使之混匀，然后放在冰上4045min。 （2）将管放于42水浴中2min。（3）然后每管直接加入1.0ml2×YT培养基，倒置混匀，并于37培养812h，干浴或水浴，不需振摇。此期间使细菌生长并开始表达

16、抗菌素。（4）每200l转化混合物分别于6个2×YT琼脂培养板上补充相应抗生素，并含有X-gal（20mg/ml）、IPTG（200mg/ml）。（5）铺板使细菌混合物干后，倒转平板放于3037培养箱中1822h。克隆在此期间应该出现，否则转化不成功。方法七：Inoue法制备超级感受态细胞越干净越好，越冷越好。1、将洗干净的瓶子（500ml三角烧瓶）用Milli-Q水浸泡2-3小时，倒去烧瓶中的水并将烧瓶倒扣在吸水纸上2-3分钟。用Milli-Q水配置250ml LB液体培养基。高压灭菌。2、准备两盒1.5ml EP管，每盒中放置两张吸水纸，共约两百个。高压灭菌。3、于早晨7-8点钟

17、小摇菌种，挑取单菌落于5ml Milli-Q水配置且灭菌的LB液体培养基（无抗性）中，37培养12小时以上（OD600大于1.5）。可以用一个新的50ml 进口离心管（costa，BD等品牌都可以）来摇细菌。4、晚上10点钟左右，按1：100大摇细菌。超静台内吸取2.5ml小摇细菌于高压灭菌的250ml SOB培养基（无抗性）中， 18-22，200rpm摇过夜。5、第二天上午测量细菌OD600值。Top10, JM109等生长速度快的细菌约在上午9点左右OD600达到0.55左右，DH5则要到下午4-6点钟（可以多摇几瓶细菌，梯度接菌，如1：50，1：100，1：200等）。6、将OD600

18、达到0.55的细菌置于冰上10min（OD600在0.4-0.8之间都可以，对结果影响不大）。7、4，4000rpm，10min集菌（用新的50ml 进口离心管）。8、超静台内弃上清，将管倒扣在事先灭好的吸水纸上，大力向下击打，尽可能去掉剩余SOB(LB?)。9、每管倒入10ml 预冷的Inoue转化缓冲液，拧紧盖子。在冰上来回滑动重悬细菌（重悬的时间与向下击打的力度和来回滑动的速度相关，这两者与感受态效率没有直接关系）。10、超静台内向每管倒入约30ml 预冷的Inoue转化缓冲液，来回颠倒混匀。11、4，4000rpm，10min集菌。12、超静台内弃上清，将管倒扣在事先灭好的吸水纸上（换

19、一张吧，别用刚才那张），大力向下击打，尽可能去掉剩余缓冲液。13、每管倒入10ml 预冷的Inoue转化缓冲液，拧紧盖子。在冰上来回滑动重悬细菌。 14、轻轻来回混匀（记住要轻轻）。置于冰上10min。 15、将冰浴的感受态细胞分装到事先灭菌后并放到-20或4的EP管中，一个一个丢到液氮罐里，然后冻到-80（建议100l每管，传说液氮速冻可以提高5倍的感受态效率）。 感受态效率在108-107不等。方法八：大肠杆菌电转化感受态细胞制备一、制备步骤1、将适合菌株（如XL1-Blue, DH5）置于LB或其他营养丰富的培养基上，在37下过夜培养。2、高温灭菌大的离心瓶（250-500ml）。准备几瓶灭菌水（总量约1.5升），保存于冷冻室中以备重悬浮细胞用。3、转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB（或其