葡萄糖淀粉酶(共9页)

1、精选优质文档-倾情为你奉上题目： 葡萄糖淀粉酶结构与功能的研究 食品学院 学院 食品科学与工程 专业班 级 食科0905班 学 号 学生姓名 田顺风 二一三年十二月葡萄糖淀粉酶结构与功能的研究田顺风（江南大学 食品学院 江苏省 无锡）摘要：本文对葡萄糖淀粉酶在微生物中的分布进行了综述，对葡萄糖淀粉酶的基本结构及作用机理、理化性质及在实际应用中的问题和拟解决途径有了初步了解，并对葡萄糖淀粉酶的应用及研究现状进行了展望。关键词：葡萄糖淀粉酶；基本机构；理化性质Research on the structure and function of glucoamylaseTian Shunfeng(Ji

2、angnan University he School of Food Jiangsu Province WuXi)Abstract: In this paper, glucoamylase distributed in microorganisms are reviewed,and we have a preliminary understanding of the basic structure and mechanism of reaction of glucoamylase, physicochemical properties and problems in practical ap

3、plications and ways to be solved.Also the application and research status of glucoamylase are discussed.Key words: glucoamylase; basic structure; physicochemical properties引言酶作为催化剂，本身在反应过程中不被消耗，也不影响反应的。酶有正催化作用，也有负催化作用，不只是加快反应速率，也有减低反应速率。与其他非生物不同的是，酶具有高度的专一性，只催化特定的反应或产生特定的构型。目前已知的可以被酶催化的反应有约4000种，已有数

4、百计的酶被纯化到结晶的形式。根据蛋白质分子的组成和盘曲折叠方式，酶可分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构。一级结构指蛋白质分子中肽链的氨基酸残基的排列顺序，由于半胱氨酸侧链巯基经氧化后形成ss键，因此在蛋白质分子的链内或链间都有可能形成二硫桥键；二级结构指蛋白质分子肽链本身的三维空间的规律性，主要由肽链骨架之间的羰基和亚氨基间形成的氢键来维系；三级结构为蛋白质分子又可按照一定方式再盘曲折叠，主要由盐键、氢键、疏水键等所维系。这样折叠后，蛋白质的肽链虽很长，但由于二、三级结构的存在，多数蛋白质在空间构型上却是紧密的球状分子；四级结构指由多条各自具有一级、二级、三级结构的肽链通过非共价键连接

5、起来的结构形式，亚基之间主要由各表面暴露的侧链形成的键（如疏水键）所维系。葡萄糖淀粉酶（glucoamylase）的系统名称为-1,4-葡聚糖葡萄糖苷水解酶或-淀粉酶，简称糖化酶1，是一种单链的酸性糖苷水解酶，具有外切酶活性。它从淀粉或类似物分子的非还原末端顺序切开-1,4-糖苷键，生成-葡萄糖。此外，它也能水解-1,6-糖苷键和-1,3-糖苷键。目前，糖化酶的研究主要集中在耐热高产菌株的筛选；糖化酶的热稳定性机理；利用DNA重组技术构建优良工程菌株等方面。酶的本质是蛋白质，因此也可用分离纯化蛋白质的方法分离纯化蛋白酶，传统分离纯化蛋白质的方法是利用沉淀原理进行的，已广泛应用于实验室及工业规模

6、蛋白质等生物产物的回收、浓缩和纯化。目前，用于蛋白酶的分离纯化的沉淀方法主要有有机溶剂沉淀法、盐析沉淀法、等电点沉淀法、热变性沉淀法等。葡萄糖淀粉酶的简要特征如表1。表1葡萄糖淀粉酶GA系统命名及别名-1，4-葡萄糖苷酶糖化酶-淀粉酶淀粉葡糖糖苷酶主要来源黑曲霉（A. niger)泡盛曲霉（A. awamori）米根酶（Rhizopus oryzae）臭曲霉（A. foetidus）作用机制快速水解-1,4-糖苷键缓慢水解-1,6-糖苷键和-1,3-糖苷键将淀粉水解成-葡萄糖应用领域轻工、食品、医药、发酵等行业1糖化酶在微生物中的分布及组分多型性工业用糖化酶主要是从霉菌、酵母等真菌中提取的，从

7、细菌中也可得到热稳定的糖化酶，已报道的糖化酶中真菌为19个属35个种(含未确定种)，细菌为3属3种2。真菌产糖化酶组分多型性是常见的，Rhizopus nivenus和Chalara paradoca可分别产生5种和6种活性组分。Svensson等从市售的糖化酶中分离出G和G两种组分，这两种糖化酶均由单一的糖基化多肤链组成。氰化片段和N-末端氨基酸序列证明它们具有相当的同源性。对生淀粉水解能力G高于G，对于可溶性淀粉的水解G仅为G活性的75%，但对-1,4-，-1,6-键邻接处碳链水解能力相同。One等利用固相Acathose柱从市售糖化酶(A.niger)中分离出6种活性组分，每种活性组分均

8、可从可溶性淀粉中释放出单一的-D-葡萄糖终产物。这6种组分的分子量、沉降系数、化学组成、等电点、酶的动力学及其它性质上各异。培养基的成分和生长条件对糖化酶组分型性也有影响。天然的糖化酶在微生物的培养或酶的制备过程中可能受葡萄糖苷酶和蛋白酶的作用而变成多型性。Aspergillus awamorivar.kawachi的G可被蛋白酶或葡萄糖苷酶水解成Gn。Takahash认为Rhizopus糖化酶转化成三种活性组分主要是蛋白酶的作用。A.niger产生的四种组分糖化酶G、G、G、GIV在培养过程中对两种蛋白酶有不同的敏感性。2糖化酶的基本结构及作用机理2.1糖化酶中的糖和蛋白组成糖化酶是一种糖蛋

9、白，通常碳水化合物占4%-18%，但S.diastaticus糖化酶碳水化合物高达80%，这些碳水化合物主要是半乳糖、葡萄糖、葡糖胺和甘露糖。A.niger糖化酶I中的碳水化合物以糖昔键与L-苏氨酸和L-丝氨酸相连接，其组分为20个甘露糖、11个2-0-D甘露毗喃-D-甘露糖结构的双糖，8个三糖和5个四糖，三糖和四糖是由D-葡萄糖、D-甘露糖和D-半乳糖以1.3或1.6糖苷键构成的。在糖化酶中这种糖残基的排列在其热和酸碱稳定性上有着特殊的意义。大部分糖化酶的氨基酸组成都已确定。不同组分糖化酶的氨基酸组成不同，A.nigerG的616个氨基酸序列中，1-512残基与G相一致3。到目前为止已有多种

10、糖化酶根据它的氨基酸序列推断出它的DNA序列，并在工程菌株的构建上得到广泛的应用。A.niger糖化酶和A.saitoi糖化酶中色氨酸残基起着酶与底物结合的作用。不同来源的糖化酶最适结合位点的氨基酸序列具有5个高度同源片段(S1一S5)，但S5不具备催化活性。Boel等4首先从A.niger的染色体文库中分离出糖化酶的基因，它含有5个内含子，而A.awamori中含有4个内含子。它们均含有第5个内含子，这个长169bp序列参与G、G mRNA的加工过程。在含淀粉培养基上编码A.awamori糖化酶的2.3kb mRNA成数百倍地增长，而在含木质素培养基上则无此片段。用2.3kb糖化酶特异性mR

11、NA制备的cDNA探针，从A.awamori染色体文库中筛选出了3.4kb的糖化酶基因，序列分析后推断可能的氨基酸序列，结果证明与已知的A.awamori糖化酶和A.niger糖化酶的氨基酸序列一致。Toshihiko等构建了水解生淀粉的Rhizopus oryzae糖化酶基因的物理图谱。 糖化酶是糖苷水解酶（Glycoside hydrolase）的一种。一般糖苷水解酶由催化域、连接域及结合域组成。根据这5个结构域的位置关系，真菌糖化酶属于糖苷水解酶的第15族，以别于第13族的-淀粉酶及第14族的-淀粉酶。黑曲霉糖化酶有型（GA）和型（GA）2种类型。型糖化酶由3个功能区组成，即催化域（Ca

12、talytic domain，CD）、淀粉结合域（Starch binding domain，SBD）及用于连接CD与SBD的O-糖基化连接域（O-glycosylation connected domain）。黑曲霉型糖化酶CD为N端的1470残基，Mr为55000；SBD为C端的509616残基，Mr为12000。GA经过限制性水解可转化为GA，GA缺少SBD，少数GA甚至缺少O-糖基化连接域。2.2催化域的结构及催化机制 泡盛曲霉X100的糖化酶CD中含有13股-螺旋，除-螺旋外11均参与折叠成“桶”状（/）6结构，桶的核心为一个口袋结构，催化中心位于其中，-螺旋1、3、5、7、9和11

13、位于桶状结构的表面，-螺旋2、4、6、8、10和13位于桶状结构的内部。黑曲霉及子囊菌酵母糖化酶CD的构型与泡盛曲霉X100的CD构型基本相似，但子囊菌酵母CD含有X100股CD螺旋，其中的12股-螺旋形成与泡盛曲霉、黑曲霉CD类似（/）6结构。Sauer5等认为黑曲霉糖化酶水解-1,4-糖苷键的机制是典型的酸碱催化，Glu179和Glu400分别为催化中心的质子供体和质子受体，Glu179提供的质子传递给淀粉链中易断裂键的糖苷氧上，形成含氧碳正离子，在Glu400 协助下接受水的亲核攻击而使糖苷键断裂（图1）。同时，使水解产生的-D（+）-葡萄糖变成-D（+）-构型。图1黑曲霉糖化酶催化过程

14、中的电子传递路径2.3淀粉结合域的结构及结合淀粉的分子机制糖苷水解酶的底物结合域，又称多聚糖结合域（Polysaccharide binding domain，PBD）6，在不同的酶中，PBD有不同的名称。在淀粉酶中，称为淀粉结合域（Starch binding domain，SBD）。PBD对酶的功能有重要作用，如果PBD缺失，酶水解可溶性底物的速率不变，但水解非水溶性底物的速率大大降低，如GA（缺少SBD）水解非可溶性淀粉的速率只有GA的1/25。SBD上有2个结合位点（位点1和位点2），可同时结合2分子的底物。Sorimachi等以淀粉类似物-环式糊精（-cyclodextrin，CD）

15、为底物，发现CD的非极性面结合到位点1和位点2的特定氨基酸的芳香环上，且该2位点的氨基酸残基是保守的。正常情况下淀粉颗粒中的淀粉链之间是相互平行的，而结合在SBD的2个位点上的2条淀粉链的方向几乎是相互垂直的。由此可以推断，SBD扭转了淀粉链的方向，使更多的底物向催化域中心靠近。2.4连接域的结构 糖化酶连接域起连接CD和SBD的作用，该结构域一般被O-糖基化修饰6。来自不同真菌的糖化酶尽管催化域和SBD的氨基酸序列有较大相似性，但在O-糖基化区域上可变性较大。泡盛曲霉GA连接域的分子动力学模型指出，在生物活性条件下，甘露糖比半乳糖更容易以O-连接方式连接到连接域的Ser和Thr残基上，平均每

16、个Ser和Thr残基上连有5个甘露糖，在pH4.5、57条件下该结构域的长度为9.5nm。3糖化酶的理化性质3.1糖化酶的热稳定性和pH值稳定性工业上应用的糖化酶都是利用它的热稳定性，因为到目前为止还没有理想的常温水解生淀粉的糖化酶产品。筛选热稳定的糖化酶生产菌株是世界范围的研究课题。Fogarty曾报道Aspergiluss niger IMDCC No.1203糖化酶活性最高温度为70。A.niger糖化酶在NaBH3CN存在可以与高碘酸氧化葡萄糖T70结合，形成一种复合体，这种复合体比天然的酶更具热稳定性。70，18%麦芽糊精条件下，复合体的酶活可达到天然酶活的二倍。Fogarty认为肽

17、链中的氨基基团通过改变氨基的功能，然后与氧化多糖结合，以增强它的热稳定性。-环状糊精(10Ommol/L)在60下，可使糖化酶的稳定性提高。但在低温条件下(30和40)作用不明显。和环状糊精及其它糖类对糖化酶的稳定性影响较小。-环状糊精对酶的热稳定性影响的机理还有待进一步研究7。细菌产生的糖化酶耐高温的性能优于真菌，Ctosrridiu，rhermodro-sufurieum糖化酶是目前已报道的糖化酶中耐热温度最高的酶，在50%淀粉溶液中70下酶完全稳定。即使在85下处理1h其酶活性仍能保持50%，而且这种酶不受Ca2+、EDTA和-、-、-环状糊精的影响。一般糖化酶都具有较宽的pH适应范围，

18、但最适pH多为4.5-6.0。Fogartyl报道A.niger IMDC No.1203产生的糖化酶pH稳定范围2.011.0。Candida tsukubaensis糖化酶pH范围2.4-4.8。3.2糖化酶的底物亲和性糖化酶是将麦芽糖一糊精转化为D-葡萄糖8，底物的水解速率主要受底物分子的大小及结构的影响，同时也受水解碳链序列中下一个键的影响。A.niger糖化酶对淀粉、麦芽三糖和麦芽糖三种底物的相对亲和性分别为100%、68%和31%。碳链越长亲和性越大，它的最大反应速度是随着底物碳链的增长而增加的，呈线性变化。Fogartyl的研究表明糖化酶水解麦芽糖的能力是异麦芽糖的100倍。6-

19、葡萄糖基麦芽糖的水解速率仅为麦芽糖的45%，这表明邻近-1,4链的-l,6糖苷键比独立的-1,6链更易被打开。4糖化酶在实际应用中的问题及拟解决途径尽管糖化酶在工业生产中价值很大，对其基础与应用研究也取得了长足进展，但仍有许多问题尚待解决。这些问题的存在严重影响着糖化酶的进一步开发，甚至成为发展的瓶颈。4.1水解-1,6-糖苷键的性能差 生产中使用的原料淀粉一般是直链淀粉和支链淀粉的混合物，由于其水解-1,6-糖苷键的性能差，因此产物中含有异麦芽糖（为葡萄糖二聚体，2个葡萄糖之间以-1,6-糖苷键相连），从而降低其产量及纯度。解决这个问题的方法是添加高效水解-1,6-糖苷键的普鲁兰酶，但实际使

20、用中发现很难找到二者共同的最适pH值和温度，因而使用这2种酶共同作用仅使葡萄糖产量从94.5%提高到95.5%，成效低微。大多数菌株来源的糖化酶水解-1,4-糖苷键的活力是水解-1,6-糖苷键活力的500-1000倍，但来自Hormoconis 的糖化酶水解-1,4-糖苷键的活力只比水解-1,6-糖苷键的高36倍9。结构比较发现，糖化酶CD的回环3和回环5与大多数糖化酶的很不相同，改变回环3和回环5结构，其重组酶的催化活力没有降低，但降低了酶对糖苷键选择的特异性。若单独突变2个回环结构中的一个，将会降低酶的水解活力。糖化酶这种性质的改变，可以为我们扩展糖化工业的原料，如仅含-1,6-糖苷键的寡

21、聚异麦芽糖和潘糖，可以降低对底物的纯度限制，提高葡萄糖产量，对工业生产有重要意义。4.2水解特异性低 糖化酶除能高效降解-1,4-糖苷键外，还可以以非常低的速率降解-1,2-、-1,3-、-1,6-糖苷键。作为其逆反应，糖化酶也可以重新形成这些键，合成以-糖苷键相连的葡萄糖二聚体、三聚体及四聚体。淀粉在降解过程中需要相当高的浓度（32%），其产物葡萄糖的浓度也非常高（最高达95%）。如此高浓度的葡萄糖使得其逆反应加快，产生含-1,6-糖苷键的异麦芽糖。由此可见，提高糖化酶水解特异性，减弱糖化酶逆反应可以通过基因工程的手段来实现。在生产中，解决这一问题的另一种方法是平衡酶的计量，控制反应温度及反

22、应时间，因为在反应后期，酶的热不稳定性导致酶活的丧失，使得逆反应减弱10。4.3热稳定性不够 在工业生产中，淀粉液化、糖化需要很高的温度，但酶在长时间高温条件下易失去活性，使反应速率下降，因此人们正试图通过各种方法降低淀粉液化和糖化温度，同时通过生物学手段提高糖化酶的热稳定性。试验发现催化域中的-螺旋1和2间的回环结构对糖化酶热稳定性及底物选择性影响很大，同时控制糖化酶不可逆热敏性，防止糖化酶发生热变性。研究指出该回环位于催化域的440-471残基，是一段高度O-糖基化的区域。Liu11等通过定点诱变的方法改变其个别氨基酸残基（其中一个氨基酸位于与热敏有关的一段O-糖基化区域），增加了催化域的

23、热稳定性；替换部分催化域外围回环区的一段易引起热不稳定的氨基酸残基，拉近该结构与剩余催化域的空间距离，维持酶的折叠状态，可提高酶的热稳定性。同时，也有人利用定点突变技术取代其中的某个氨基酸，如-螺旋中的Gly或Asn-Gly序列中的Asn，均在一定程度上提高了酶的热稳定性。4.4pH稳定性低 糖化酶对酸碱环境的适应性取决于催化基团的解离，这种解离受微环境的影响。Fang12等认为泡盛曲霉和黑曲霉糖化酶Glu400的极性、电荷分布及与Glu400形成的氢键等影响着酶的最适pH值，他们利用定点突变技术将Ser411突变为Gly411，去除了Ser411和Glu400之间的氢键，则提高了酶的最适pH

24、值。因此尽管目前的糖化酶对酸碱的适应性较低，但通过酶学改造是可以改善的。4.5解决途径 针对上述问题，解决的途径也许很多，包括工业流程的改进等13。我们仅从酶结构和功能的角度提出如下几条途径。继续利用常规方法选育高产和高活力菌株 我国是糖化酶制剂的生产和消费大国，生产酶制剂的菌种丰富，研究队伍强大且相对稳定，常规的物理和化学方法成效显著，不能忽略。加强基础理论研究 从本质上说，酶学特性是受其结构决定的，因此，继续加强糖化酶的基础理论研究，如挖掘新的基因资源、阐明酶的结构、了解基因的特性等，对改善糖化酶特性具有重要指导作用。将新的分子生物学技术应用于菌株选育研究中 如定点突变技术、定向进化技术等

25、。常规的物理和化学选育方法尽管有一定成效，但周期长，且因突变范围有限，难以大幅度提高酶的特性。定点突变能大幅度改善酶特性，但它是理性的，需要较强的结构F功能方面的研究基础，因此应用上受到一定程度的限制。相反，定向进化是非理性的，它利用DNA重组或扩增过程中的错误配对使基因的碱基发生突变，再通过定向筛选在短时间内获得需要的新基因、新蛋白，甚至新物种，在改造酶活力、底物特异性、酶对环境的适应性、蛋白功能等方面取得了明显的效果，进化的酶分子特性与对照组相比提高了数百倍、甚至数千倍，最新的报道显示利用此技术改造的天冬氨酸转氨酶的催化效率提高了2.1×106倍，因此定向进化技术是高效改造糖化酶

26、特性的重要技术，将为糖化酶的研究提供更广阔的空间。5糖化酶的应用及研究现状糖化酶在工业生产中的应用非常广泛。在酒精工业中，糖化酶制剂可代替自制麸曲，简化生产工艺，提高生产效率。在淀粉糖工业中，利用糖化酶水解淀粉的高度专一性，避免无机酸水解淀粉糖苷键的随机性，控制糖浆产品的糖分组成，提高产品纯度，克服酸水解时对生产设备的腐蚀14。在干啤酒酿造过程中，可提高麦汁中可发酵性糖的含量。在白酒和曲酒生产中，以糖化酶代替酒曲，可以提高出酒率，降低粮耗，改善酒的口味，提高质量8:9。在味精、柠檬酸等生产过程中，首先利用淀粉酶、糖化酶将其主要原料淀粉转化成低分子量糖类，再经发酵得到谷氨酸和柠檬酸。因此，糖化酶

27、在轻工、食品、医药、发酵等行业中具有广泛的应用价值，受到国内外学者的高度重视。随着研究的深入，对其酶学结构、作用机理、结构+功能相关性等问题有了一定的了解，同时有人将这些研究成果应用于菌种选育中。本文在总结糖化酶有关研究成果基础上，重点对其结构+功能关系的研究进展做一综述，并从这一角度出发，对当前生产中存在的主要问题提出了拟解决途径15。我国对糖化酶的研究已有很大进展，管汉成等从A.niger突变菌株中纯化了水解生淀粉的Gl和即不为生淀粉吸咐又不水解生淀粉的G，并对其性质进行了研究。方善康等也从A.niger中纯化了三种组分的糖化酶，它们均为酸性糖蛋白。我们实验室于1993年开展嗜热真菌的研究

28、，并从Thermomyces Lanuginosus中纯化了-淀粉酶及糖化酶。在热和酸碱稳定性上T. Lanuginosus糖化酶均优于其它霉菌产生的糖化酶。以上研究对于深人了解糖化酶的作用机理，分析其结构与功能的关系是非常必要的。近年来国内已开始借用分子生物学手段对糖化酶的基因克隆、转化、表达进行了系列研究。唐国敏等从A.niger糖化酶高产菌株中克隆了全长的糖化酶cDNA，并进行了序列分析。随后又将合成的糖化酶cDNA，经5、3端改造，克隆到酵母质粒YFD18上，转化酿酒酵母，并能有效地分泌有功能的糖化酶到胞外，罗进贤等以噬菌体gt10DNA为载体，构建了黑曲霉3758的cDNA文库，用编

29、码黑曲霉葡萄糖淀粉酶329-418位氨基酸的DNA序列(456bP)作为探针从所建的文库中筛选出葡萄糖淀粉酶cDNA。克隆的2.1kb片段含有5端非编码区，编码葡萄糖淀粉酶的结构基因及3端的非编码区。克隆的cDNA片段在表达载体又gt11中得到表达。另有将地衣芽抱杆菌-淀粉酶基因及黑曲霉糖化酶cDNA共同重组于大肠杆菌一酵母穿梭质粒中，然后转化酿酒酵母，在酵母MF-21因子及磷酸甘油酸激酶基因的启动子和终止信号控制下，糖化酶能获得高的表达，并向胞外分泌，重组质粒具有良好的稳定性。参考文献1 DUO CHUAN LI,YI-JUN YANG,YOU-LIANG PENG.Purification

30、 and characterization of extracellular glucoamylase from the thermophilic Thermomyces lanuginosusJ.Mycol.Res.1998,102(5):568-572.2 马丽娜,陈喜文,甘睿,等. 葡萄糖淀粉酶的结构和功能研究进展J.生物技术通讯,2005,16(6):677-682.3 Yong-Xiao Bai,Yan-Feng Li,Ming-Tao Wang.Study on synthesis of a hydrophilic bead carrier containing epoxy gro

31、ups and its properties for glucoamylase immobilizationJ.Enzyme and Microbial Technology,2006,39:540-547.4 Haq Nawaz Bhatti,Mohammad Hamid Rashid.Purification and characterization of a novel glucoamylase from Fusarium solaniJ.Food Chemistry,2007,103:338-343.5 Xiaoyun Zhang,Tianliang Cao,Xueda Tian.Ef

32、fect of microwave irradiation on the structure of glucoamylaseJ.Process Biochemistry,2012,47:2323-2328. 6 Willian J.Andrioli,Tony M. Silva.The fungal metabolite eugenitin as additive for Aspergillus niveus glucoamylase activationJ.Journal of Molecular Catalysis B, 2012,74:156-161. 7 杨依军,李多川,沈崇尧.葡萄糖淀粉酶研究进展J.微生物学通报,1996,23(5):312-315.8 Yumiko Yoshizaki,Tomoka Susuki.Characterization of glucoamylase and -amylase fromMonascus anka: