铜绿假单胞菌CMCC10104中青霉素结合蛋白-3的克隆表达和纯化

1、由于抗生素可用于治疗各种感染性疾病，有的人就将抗生素作为万能药，不管得了什么病，都用抗生素治疗。要知道，滥用抗生素，可引起许多不良的后果。因此强调合理使用抗生素，重视抗生素的毒副作用是很有必要的。那么，该如何合理使用抗生素呢？ （1）病毒性疾病不宜用抗生素治疗。上呼吸道感染以及咽痛、咽峡炎，大部分是病毒感染所致，因此这类疾病无需抗生素而应使用病毒灵、病毒脞等抗病毒药物以及中草药治疗。 （2）应根据细菌培养和药敏试验结果选用抗生素。但如果受条件限制或病情危急，亦可根据感染部位和经验选用，然而可靠性较差。一般情况下，呼吸道感染以革兰氏阳性球菌为多见。尿道和胆道感染以革兰氏阴性菌为多见。皮肤伤口感染

2、以金黄色葡萄球菌为多见。 （3）抗生素可以治病，同时也会产生副作用，没有一个抗生素是绝对安全而无副作用的。如链霉素、庆大霉素、卡那霉素等可损害第八对脑神经而造成耳聋。青霉素可发生过敏性休克，还会引起皮疹和药物热。应用广谱抗生素如四环素等会使体内耐药细菌大量生长繁殖，而引起新的更严重的感染，因此使用抗生素应有的放矢，不可滥用。 （4）新生儿、老年人和肝肾功能不全的人应避免或慎用主要经肝脏代谢和肾脏排泄的毒性较大的抗生素。 （5）预防性应用抗生素要严加控制，尽量避免在皮肤、粘膜等局部使用抗生素，因其易导致过敏反应，也易引起耐药菌株的产生。铜绿假单胞菌CMCC10104中青霉素结合蛋白-3的克隆表达

3、和纯化引言：铜绿假单胞菌是一种能够感染植物、动物和人类的革兰氏阴性细菌，医院中的病人因他们的肺部、血液、尿液、皮肤、和软组织被铜绿假单胞菌感染而发病甚至死亡。铜绿假单胞菌也是一种重要的水生病原菌，广泛分布在各种各样的水体中，并且对消毒剂、干燥、紫外辐射等其他的物理化学因子具有很强的抗性，因此可以造成急性肠胃炎、脑膜炎、败血症和急性皮肤病。由于铜绿假单胞菌耐药性的出现，因此迫切需要去选择一些抗菌策略来控制它们的感染。细胞壁结构对于细菌的生存是非常的重要，青霉素结合蛋白（PBPs）是一些膜结合酶，它们主要参与到细菌细胞壁合成的后期阶段。它们在70年前就已经被开发利用，被认为是B-内酰胺类抗生素的目

4、标结合物。铜绿假单胞菌PAO1的基因组编码的四种高分子量的青霉素结合蛋白（PBPs）,包括一级A酶(PBP1a)和三级B酶(PBP2, PBP3, and PBP3a),它们与大肠杆菌中对应的酶是直系同源的。同时，铜绿假单胞菌的青霉素结合蛋白（PBP3）与大肠杆菌的对应蛋白具有42%序列一致性。铜绿假单胞菌的青霉素结合蛋白（PBP3）是有两个部分组成的蛋白，它包括：一个C-端的转肽酶结合到一个延伸的N-端领域。总的来说，PBP3与其他种类的青霉素结合蛋白是相似的，虽然它缺乏PBP2X结构所特有的C-端附属结构，但是它和其他种类的PBPS一样，都具有a-螺旋亚基或头部结构朝向PBP3的N-端，这

5、在PBP2结构中是没有的。种类B的青霉素结合蛋白的N-端区域的功能目前还不清楚，但是很有可能使转肽酶的结构远离细胞内膜。在铜绿假单胞菌中PBP3是一个药物作用靶点，并且已经证明了是大部分B-内酰胺类抗生素的重要的药物作用靶点，B-内酰胺类药物通常是用于治疗假单胞菌属的感染。包括头孢菌素类似物、头孢霉素、头孢他啶、哌拉西林、和注射用药物的抗生素、多利培南。然而，在最近几年，青霉素结合蛋白的改变使得铜绿假单胞菌对B-内酰胺类的抗生素具有耐药性。使用高剂量的哌拉西林来处理临床的分离菌，表明了这与抗生素结合到PBPs上的减少有关。实验菌株缺乏B-内酰胺酶，在铜绿假单胞菌中PBP3的过量表达导致了它们对

6、头孢霉素的敏感性降低。因此，进一步研究PBP3的基因和结构是很有必要很有意义。铜绿假单胞菌CMCC 10104是一种典型的培养菌株，在中国广泛使用。然而，它的基因组和蛋白质组学的研究没有报道过。在本研究中，根据铜绿假单胞菌PAO1的基因组信息将编码PBP3的基因从铜绿假单胞菌CMCC 10104中克隆出来，克隆出来的基因和GenBank数据库中报道过的其他PBP3基因序列进行对比，不同之处是实验的条件优化了蛋白的表达。带有Ni2+NTA 琼脂糖的固定化金属亲和色谱层析(IMAC)法用于纯化重组蛋白PBP3，纯化的PBP3蛋白的活性通过青霉素结合实验来测定。材料和方法细菌、质粒、酶、试剂和培养基

7、：菌株P. aeruginosa CMCC 10104是从中国的菌种保藏中心获得，大肠杆菌DH5a 用于载体的转化，E. coli BL21 (DE3)用作蛋白表达的宿主菌，质粒pMD19-T和pET44b分别用于T-A克隆和蛋白质的表达。限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶和Taq DNA聚合酶都是购于Takara (Japan).分子生物试剂盒和IMAC等仪器试剂都是来源于BIO-RAD (USA).其他的分析试剂都是购于上海生工试剂公司。大肠杆菌通常培养在LB培养基（10 mg/mL tryptone, 5 mg/mL yeast extract, 10 mg/mLNaCl）中，37、振荡

8、培养，当菌株中转入了pMD19-T或pET44b (+)时，应在培养基中加入100 ug/mL氨苄青霉素。为了使克隆基因过量表达，将菌株在2倍的YT培养基（16 mg/mL tryptone, 10 mg/mL yeast extract ，5 mg/mL NaCl.）中培养。PBP3基因的克隆：P. aeruginosa CMCC 10104的染色体DNA 从过夜培养的菌液中得到，并用于编码PBP3基因的PCR扩增的模板，根据P. aeruginosa PAO1的 ftsI 基因来设计引物，引物如下：5> CGcatatgGACCTGCACGTGATCGACCA<30(sense

9、 primer, containing Nde I digestion site) , 5> TActcgagGCCACGCCCTCCTTTTGCG <3 (anti-sense primer,containing Xho I digestion site). ftsI 基因的平末端省略了编码疏水前导肽的基因，用这个引物进行扩增，起始的变性温度为94，5min，PCR反应是由Taq DNA聚合酶完成的，每次循环的条件如下：变性：94，30s 退火：63，30s延伸：72 ，1.5min 。最终的延伸过程：72 ，10min，循环30次。扩增的产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行纯化并插入

10、到pMD19-T载体中，获得的重组载体pMD19-T-PBP3转入到感受态细胞E. coli DH5a中，并加以测序确定核苷酸同源性。正确的重组质粒pMD19-T-PBP3被Nde I and XhoI酶切，PBP3基因片段被提取出来并且正确地连接到质粒pET44b (+)DNA上。这个重组质粒被命名为pET44b-PBP3，然后转入到E. coli BL21 (DE3).中。各自的结构从转化子中分离出来，并且通过限制性核酸内切酶Nde I 和 Xho I的酶切后将正确大小的插入片段筛选出来。他们再一次被测序确认核苷酸同源性。最终的结构将PBP3基因结合到带有组氨酸标记的质粒上。重组PBP3

11、(rPBP3)的表达：具有pET44b-PBP3重组载体的E. coli BL21 (DE3)的单个菌落接种在含有5ml LB培养液、100 ug/mL氨苄青霉素的15ml的离心管中培养。种子培养液接种在摇瓶中，在37、200 rpm条件下过夜培养。这些细胞再接种到含有100ml的2 _ YT培养基、100 ug/mL氨苄青霉素的500ml的摇瓶中培养。在37下震荡培养4h,浓度为2mM异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)添加到培养液中，诱导蛋白的表达。诱导培养3h后，通过8000 rpm的转速进行离心收集细胞，并且通过SDSPAGE进行分析。去改善蛋白的表达，通过改变发酵的温度、诱导时间、诱

12、导物的浓度等不同的条件来试验。改变的条件如下：温度为37或者25，诱导时间分别为1 h, 2 h, 3 h, 4 h 、 5 h ，诱导物的浓度为0.5 mM 到 4 mM.通过SDSPAGE来分析蛋白表达的水平。大规模蛋白的生产： 大规模重组蛋白的生产过程是：首先将单菌落接种到含有100 lg/mL氨苄青霉素的25ml的LB培养基中培养，再将种子液接种到摇瓶中37、200 rpm下过夜培养。最后将过夜培养的种子液接种到2.5L的发酵罐（含有1.0L的2 _ YT培养基、100 lg/mL氨苄青霉素）中培养。培养到菌液的OD600 nm =0.6 。添加2 mM IPTG进行诱导表达，细胞菌体

13、进一步在37下培养3h 。通过离心收集菌体细胞(8000 rpm, 4 _C, 15 min),并且储存在-20条件下。重组蛋白的纯化：将结冻的细胞进行解冻，取8g的菌体细胞用200 mL裂解缓冲液(20 mM磷酸盐缓冲液，Ph7.0)重悬，用超声破碎法将细胞破碎。裂解液在12,000 rpm、4条件下离心10min。将上清液储存在4中，并通过0.45 um滤膜进行过滤纯化。Bio-Rad NGC蛋白纯化系统和Bio-ScaleMini Profinity IMAC(固定化金属亲和色谱) 用于重组蛋白rPBP3.的纯化。整个纯化的过程流速设定为2 mL/min。首先，用2体积的水和5体积的裂解

14、缓冲液冲洗填充柱，然后将3035ml的过滤上清液装株，接着用5体积的裂解缓冲液（含有520mM咪唑去除受污染的蛋白）洗脱，最后，用洗脱缓冲液(20 mM 磷酸盐缓冲液, pH 7.0, 0.5 M NaCl and 0.25 M 咪唑).将rPBP3从柱上洗脱下来。大的碎片通过SDSPAGE来分析，包含了高浓度的rPBP3的碎片被合并，并且用50体积的20mM的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)进行反向透析，4、6h。为了脱盐，这个透析步骤需要重复两次。接下来进行离心（12,000 rpm 、 10 min 、 4）将聚合物去除。通过浓缩器将这些蛋白质进行浓缩并用于分析。(SDSPAGE)十二烷基硫

15、酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳：分子量大小、表达水平、重组蛋白的浓度由SDSPAGE进行分析确定。在每个凝集凹槽中添加10ul的样品，电泳结束后，用考马氏亮蓝R-250对胶体进行染色，然后用混合液（醋酸：甲醇：水=10:25:65, v/v/v）进行冲洗。蛋白质浓度的测定：Bradford方法用于测定蛋白质浓度，在595nm的波长处读取吸光值，牛血清蛋白被用作标准曲线的制备。Western-blot分析：Western 免疫印迹法分析和先前所描述的基本一致，以1:1000的稀释比例的抗组氨酸单克隆抗体作为第一抗体，以1:2000的稀释比例的抗-兔的免疫球蛋白G和辣根过氧化氢酶结合到抗体上作为第二抗体。

16、DAB被用作检测试剂。青霉素结合的活性：通过SDSPAGE来分析纯化了的rPBP3，从而检测青霉素结合的活性，35，15ul纯蛋白样品和5ul的BOCILLIN一起孵育2h，SDSPAGE样品缓冲液被添加到蛋白质样品中，并在电泳之前煮沸10min，不含蛋白质的样品或用青霉素标记了的样品作为空白对照。rPBP3-BOCILLIN混合物的测定是通过胶体在UV290nm 的波长来完成的。结果：PBP3基因的克隆和分析P. aeruginosa CMCC 10104的染色体DNA被用着编码PBP3蛋白基因的PCR扩增的模板，根据P. aeruginosa PAO1 的ftsI基因来设计克隆的引物，ft

17、sI基因的平末端被扩增，这个平末端省去了编码疏水前导肽的序列。PCR产物通过1%的琼脂糖凝胶电泳来鉴定，结果如图1(lanes 13)所示。扩增产物的长度为1500 bp 2000 bp,这与PBP3的理论长度(1635 bp).相一致。扩增的片段被提取并连接到pMD19-T载体上，这个重组载体导入到感受态细胞E. coli DH5a，并通过限制性核酸内切酶酶切确定，并加以测序。用Nde I 、Xho I 双酶切得到的两个片段包含了PBP3 (1635 bp)和pMD19-T simple (2692 bp, lane 4 of Fig. 1).基因测序结果如图2所示，结果表明了插入的序列是正

18、确的，克隆DNA的核酸序列和P. aeruginosa PAO1的ftsI基因序列相似度达到了99.76%这里有四个不同的碱基（66 C-A, 1020 T-C, 1233 T-C, 1527 T-C）。然而，至于氨基酸的序列，和他们是没有差别的。正确的重组质粒pMD19-T-PBP3被Nde I、 Xho I 酶切.PBP3片段被修复并插入到pET44b (+)质粒DNA上，这个重组质粒被命名为pET44b-PBP3 (Fig. 3)并转入到E. coli BL21 (DE3).单个的结构被分离和验证，用Nde I 和 Xho I双酶切后产生了两个片段，他们分别是PBP3 (1635 bp)

19、 、pET44b (+) fragment (5495 bp, lanes 57 of Fig. 1).DNA测序的结果也表明插入片段的基因序列和预期的结果是一致的，重组表达的载体被构建后，经过实验证明是正确的，这也为表达重组蛋白做好了准备。重组蛋白PBP3的表达具有pET44b-PBP3 重组载体的单菌落被用于重组蛋白PBP3的生产，克隆基因的过量表达，种子培养液在2 *YT培养基中培养，用IPTG诱导物诱导之后，离心收集菌体，通过SDSPAGE进行分析，分析结果如图4，PBP3蛋白的理论分子量为60kDa，经IPTG诱导后，出现了一个新的蛋白，分子量大约也为60 kDa。这个结果表重组PB

20、P3蛋白成功表达。为了提高蛋白的表达，通过改变不同的条件来进行实验，如：改变发酵温度、诱导时间、诱导物IPTG的浓度。最终我们得到最优的表达条件是：37 _C for 3 h by 2 mM IPTG.蛋白质的大规模生产将优化的表达条件应用于大规模的蛋白生产，在优化的条件下，细胞的湿重产量是8 ± 0.5 g/L。rPBP3主要以溶解状态存在于细胞裂解液的上清液中(see lane 5 of Fig. 5).，同时，少部分的rPBP3存在于球形碎片中，因而不能被额外的超声处理而去除，(see lanes 3and 4 of Fig. 5),这表明是由包涵体导致的，而不是没有充分的裂解

21、。企图使用不同的洗涤剂去增加重组蛋白PBP3的可溶性。(e.g., Tween 20 and Triton X-100)，但是都没有成功，降低大肠杆菌的培养温度也没有增加可溶性蛋白的量。rPBP3的纯化细胞裂解液的上清液部分被用于重组蛋白的纯化，然而，在4时可溶性rPBP3的部分上清液趋于沉淀，这些沉淀的蛋白在纯化之前必须通过离心或者经过注射器过滤器而去除，将过滤后的上清液进行装柱，再用含有520 mM咪唑的裂解缓冲液冲洗将污染的蛋白进行去除，用洗脱缓冲液把rPBP3从柱子上洗脱下来，再用SDSPAGE分析，将含有高纯度的rPBP3的液体进行收集并合并在一起。结果如图5所示，结果表明获得的高纯

22、度的蛋白纯度达到了95%，分子量大约为60 kDa.蛋白的测定在4时，用20mM 磷酸缓冲液对纯化的rPBP3进行反向透析，达到脱盐的目的，接着离心（12,000 rpm for 10 min）去除聚合物。用磷酸缓冲液透析结果使rPBP3沉淀，通过离心和浓缩，将蛋白质浓缩，Bradford 方法来测定蛋白质，纯化的结果如表1所示。最终纯化得到的rPBP3是48 mg/L (6 mg/g wet weight cells).重组蛋白rPBP3的鉴定Western-blot用于蛋白质的进一步的鉴定分析，兔的抗组氨酸单克隆抗体和羊的抗兔的免疫球蛋白G分别被用作第一和第二抗体，通过DAB的测定，一个新

23、的蛋白条带大约为60 kDa（如图5 ）青霉素结合活性 纯化的rPBP3用于青霉素结合活性的测定，结果如图5所示。纯化的rPBP3能够结合到BOCILLIN FL,用荧光标记的青霉素。这个发现表明了获得rPBP3是由功能的，通过C-端组氨酸标记的存在表明了它并没有阻碍它结合青霉素的能力。讨论P. aeruginosa是一种典型的铜绿假单胞菌属，是人类和动物的主要条件致病菌之一，细菌学的研究分析结果表明在不同的医院都有假单胞菌属，主要是铜绿假单胞菌，从医院里感染革兰氏阴性细菌的病人的血液、唾液以及其他的临床资料中度可以分离到这些细菌，铜绿假单胞菌的存在还与病人的囊胞性纤维症并发症有联系的，或者是外科、创伤、灼烧等有关，铜绿假单胞菌被认为是第二大最频繁的病原体在外科手术中，在医学界是第三。因此，迫切需要去发现一些方法去控制它的感染。P. aeruginosa CMCC 10104是典型的菌株，在中国广泛使用，然而，对于它的基因组学和蛋白质组学还没有研究过。在本研究中，根据P. ae