目的基因双酶切和电泳纯化胶回收实验报告

1、题目：目的基因双酶切和电泳纯化胶回收一. 实验目的:1. 学习双酶切法获取目的基因片段的原理和方法；2. 练习DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。3. 学习核酸琼脂糖胶回收的原理和方法。二. 实验原理1. 限制性核酸内切酶：生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。由于这种切割作用是在 DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶(简称限制酶)。2. 切割序列：(1) Bam HI切割识别序列后产生两个互补的粘性末端：5' ? G J GATCC? 3' 5'? G GATCC?3'3' ? CCTAGt G ? 5' 3'? C

2、CTAG G?5'(2) Eco R I切割识别序列后产生两个互补的粘性末端：5' ?GJ AATTC?3' 5' ?G AATTC?3'3' ?CTTAAf G ?5' 3'? CTTAA G?5'3. 为什么要选择表达载体质粒 pET-28a ?pET原核表达质粒是最有效的原核表达系统之一。目的基因被 克隆到pET质粒载体上，受噬菌体 T7强转录及翻译信号控制；表 达由宿主细胞提供的 T7RNA聚合酶诱导。宿主菌带有受lacUV5控制的T7RNA聚合酶基因，可以通过IPTG来启动表达。充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用

3、于表达 目的蛋白；诱导表达后仅几小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋 白的50%以上。4. 限制性内切酶的选择：选择BamHI、Notl两个位点由于实验中须将质粒 pEGFP-N3上所需的目的基因切下并连接到 载体质粒pET-28a上，所以选择的限制酶需满足以下几个要求：一. 选择两种在质粒 pEGFP-N3和载体质粒pET-28a上都有酶切 位点的限制性酶切酶，以保证切下的目的基因和载体质粒分别都 有两个不同的末端，这样可以防止：(1) 质粒和目的基因的自身环化；(2) 质粒与质粒、目的基因与目的基因相互自身连接；(3) 质粒与目的基因反向连接)二. 两种限制性内切酶的酶切位点需满足：(1)

4、不破坏目的基因；(2) 在质粒pEGFP-N3和载体质粒pET-28a上都有且只有一 个酶切位点；(3) 在载体质粒上的切割位点距离尽量短些，并且不破坏载体质粒的启动子等关键序列。载体质粒pET-28a和质粒pEGFP-N3的酶切位点示意图:&W Ilk ?'. > I ! a'l £*|片+血IQi I#b<17i .Eu 14 331唱.一巒+Xh# I门亦Hind3 IjlTW缽 l<|M| 日tp k-faiNta Ipji：Nd» Inv- IM* Ijh.IlHWni W*iHt1CM»Ejod&Z b

5、piwt-;-Ad ATM EM*Bus ii.rI g :氐*刊.厂r吕J MM 9忙*Tlhlll I.J1MI艺陌I .供坤 PtpG lluai图一、pET-28a的酶切位点示意图图二、质粒pEGFP-N3勺酶切位点示意图HlW1E51671 EGFP'伽 B删HIXm II Bsp2i I 加 I 加II 伽I0 AGATCTCGAGCAAGCTTCGAATTCT GCA GTCGAC GGTACC GCGGGC CCG GGA TCC ATC GCC ACCATG GTG fiffHTXho Hi/iillil Ml P$t Sa/1如 |&/I36II图三、pEG

6、FP-N3 MCS多酶切位点示意图5. 琼脂糖凝胶回收(1 )在酶切的过程中，除产生我们所需要的目的片段外，还会产生一些小片段，这些小片段可能会与载体连接，从而产生干扰，去除这些小片段的最好方法就是进行琼脂糖凝胶电泳；(2)不同分子量 的DNA片段在琼脂糖凝胶电泳中 由于泳动速度 不一 样而分离，通过回收可用于后续实验；(3) 本次实验 使用试剂盒 进行胶回收，按说明书进行操作，可以用溶剂使琼脂糖融化，再经过吸附管吸附目标DNA冲洗，溶解后得到高纯度的目的基因片段。(4) 硅胶树脂在高盐离子浓度下可以高效专一的吸附DNA通过离心可将DNA片段沉淀下来，在碱性低盐浓度下其与DNA的结合能力会急剧

7、降低，使用弱碱溶液如 TE (pH8.0 )等可以从硅胶离心柱洗脱得到 纯净的DNA片段；三. 实验材料及设备1. 实验材料：已经提取好的PEGFP-N3质粒，1.5ml塑料离心管若干，EP管架，微量取液器和取液器吸头，常用玻璃器皿(如三角瓶、量筒、试剂瓶等)，锥形瓶，一次性手套2. 实验仪器：(1) 恒温摇床，高压灭菌锅，超净工作台，10、100、1000卩L取液 器各一支，移液枪头若干，台式高速离心机，制冰机，漩涡器；(2) 电泳仪，电泳槽，样品槽模板(梳子)，有机玻璃内槽，水平仪， 取液器，微波炉，凝胶成像系统。3. 实验试剂:(1) 目的基因的双酶切a. 核酸外切酶：Not I Bam

8、 H I酶(置于冰盒中)b. 10X buffer(with BSA) ， ddH2O(2) DNA琼脂糖凝胶电泳检测与纯化a. gene Green( DNA染 料)b. 1 x TAE缓冲液c. 上样缓冲液(6Loading Buffer )(3) 胶回收目的基因片段a.胶回收试剂盒一套，ddH2O四. 实验方法及步骤1. 目的基因双酶切a) 分别取两支0.2mlEP管做上记号：如;EP管EP管10 x buffer2卩L /10x buffer2卩L /(with BSA)3 卩 l + 3 卩 l ddl12Oth BSA)3 卩 l + 3 卩 l ddNot I1卩LNot I1卩

9、LBam H I2 卩 L / 2(1LBam H I2 卩 L / 2(1LpET-28a15 卩 L / 20(1LPEGFP-N315 卩 L / 20(1Lb）两个EP管中分别配置下列的 20 （老师提供）/30卩L（自提）体 系：（本次实验使用20卩L体系）c）将两只EP管混匀后瞬时离心，放入恒温培养箱37度酶切1h;d）酶切体系（20 卩 L+4 卩 I Loading Buffer/ 30 卩 L+6 卩 I LoadingBuffer ）全部加入点样孔进行电泳（自行配制40ml 1%电泳凝胶液做胶），Marker DNA加5卩l，电泳结束后对目的基因片段进行 胶回收。切胶前请先

10、称量装胶的1.5ml离心管重量并做记录，标记好离心管，装胶后在进行称量，算出胶的重量；e）切胶时，带好护目镜。在紫外线灯照射下清晰可见目的基因片段，亮度较高，边际清晰，回收得到含有目的基因片段的琼脂胶，称 重。f）按照回收试剂盒步骤切胶回收所需目的基因片段；g）将提取好的目的基因上交保存；2. DNA琼脂糖凝胶电泳检测a）琼脂糖凝胶板的制备b）称取0.3g琼脂糖，置于锥形瓶中，加入 30mL1x TAE缓冲液，微 波炉加热直至琼脂糖溶解；c）待胶液冷却到65度（不烫手为宜）,加入1卩L Gene green混匀， 搅拌器上搅拌排除气泡，缓慢倒入事先准备的制胶有机玻璃槽（插入样品槽模板梳子）内，

11、静置30min左右，轻轻晃动拔出梳子;3. 加样酶切体系（20 卩 L+4 卩 I Loading Buffer/ 30 卩 L+6 卩 I Loading Buffer ）全部加入点样孔进行电泳（自行配制40ml 1%电泳凝胶液做胶），Marker DNA加5卩l4. 电泳将电泳槽与电泳仪接通，调节电压为100V左右，直至缓冲液的蓝色指示剂移动到距离胶板边沿约12cm处，停止电泳。5. 观察和拍照将胶板小心取出，放入凝胶成像系统中，调节位置居中，波长为 254nm的紫外灯下，观察凝胶中 DNA存在处显示出荧光条带。五. 实验结果A 带：15000bppEGFP-N3目的基因片段B 带 lOO

12、OObpC 带 7500bpD 带 5000bpE 带 3000bpF 带 lOOObpG 带 250bp图1双酶切体系处理pEGFP-N3与pET-28a质粒凝胶电泳紫外荧光检测结果说明：从左到右依次为:pET-28a、pEGFP-N3、DL15000Maker、pEGFP-N3、DL15000Maker由图可知，pEGFP-N3泳道呈现为十分清晰的双条带，上部为酶切 后的pEGFP-N3质粒，下部为目的基因片段，无拖影，无杂带，说明 目的基因纯度较高，数量较多，前一实验提取的质粒纯度较高。与 Marker比照，酶切理论上会产生约4000bp和约800bp的条带，预期分子量基本符合对应的分子

13、量条带，实验结果较好。pET-28a泳道共产生了四条条带，除了最上层清晰的5000bp条带，还应该出现30bp的条带，但该条带由于分子量太小，很有可能 已经脱出琼脂胶，无法在结果上显示，所以另外的三个条带推测为前 一次实验提纯质粒时混入的RNA或其他杂质。切胶时，带好护目镜。在紫外线灯照射下清晰可见目的基因片 段，亮度较高，边际清晰，回收得到含有目的基因片段的琼脂胶，称 重结果为约1.1g。胶回收完成后，得到少量溶有目的基因片段的PE管一支。六. 结果讨论与结论：1. 实验结论：根据琼脂糖电泳紫外荧光检测结果可见，各泳道拖影现象不明 显，pEGFP-N3泳道条带清晰，无扭曲现象，无杂带，酶切结

14、果较 好；pET-28a泳道由于只是切开一个缺口，理论上只应该有一个清晰 条带，实验结果符合预期。和Marker对照分子量符合理论结果，实验结果良好，可继续用于下一次实验。2. 讨论一：影响酶切效率的因素有哪些？答：DNA的质量，限制性内切酶活性，酶的用量，酶切时间，酶切温度，缓冲液的条件3. 讨论二：在实验操作中，取用酶试剂时操作应注意哪些方面？答：（1）放在冰上使用，让酶一直处于低温环境，保持活性；（2）取用不同的酶时要换新枪头，不要污染酶试剂。4. 讨论三：实验操作中，怎样能使微量的试剂混合均匀？答：（1）加入试剂时，尽量在管底部加入；（2）可进行瞬时离心。5. 讨论四：本次实验酶切结果较好，可能是哪些原因？答：（1）在酶切之前，轻柔混匀酶与质粒多次， 加快反应，提高效率；（2）适当延长酶切的时间，保证反应的完成度。（3）前一次提取的质粒数量和质量较高， 提高了本次实验的成功率。6. 讨论五：胶回收时的注意事项？（1）检测时用小梳子，减少损耗（2）回收提纯时用大梳子，提高效率（3）称取胶的重量，是为了确定 PC溶液的质量，避免浪 费和其他不可预知的影响。（4）用平衡液处理吸附柱，直接影响后续的实