安徽中医药大学药学院 革兰氏染色

1、细菌形态观察和革兰染色法细菌形态观察和革兰染色法微生物实验室的生物安全微生物实验室的生物安全n微生物实验的对象大多是活的病原微生微生物实验的对象大多是活的病原微生物，具有感染性，因此必须建立严格的物，具有感染性，因此必须建立严格的“无菌观念无菌观念”。严格按照实验操作规程。严格按照实验操作规程操作，防止在实验过程中造成自身感染操作，防止在实验过程中造成自身感染和环境污染。和环境污染。微生物实验室操作规程微生物实验室操作规程一、书包、衣物等不要带入实验室，必要的工具一、书包、衣物等不要带入实验室，必要的工具带入后，应放置在远离操作部位处。带入后，应放置在远离操作部位处。二、进入实验室后穿上工作服

2、，离开时脱下，反二、进入实验室后穿上工作服，离开时脱下，反折。折。三、实验室内应保持安静、整洁、有秩序。不得三、实验室内应保持安静、整洁、有秩序。不得高声谈笑，随便走动，以免影响他人实验。高声谈笑，随便走动，以免影响他人实验。四、实验室内严禁饮食、吸烟。四、实验室内严禁饮食、吸烟。五、发生菌液误吸时，应及时报告指导老师，给五、发生菌液误吸时，应及时报告指导老师，给予处理。予处理。六、用过的吸管、滴管、试管、玻片等应放在指定六、用过的吸管、滴管、试管、玻片等应放在指定的污物缸或试管筒内，严禁放在桌面上或水池内。的污物缸或试管筒内，严禁放在桌面上或水池内。七、爱护公物、节约使用实验材料，器材如有损

3、坏，七、爱护公物、节约使用实验材料，器材如有损坏，应及时报告指导老师，听候处理。应及时报告指导老师，听候处理。八、实验完毕，整理桌面，将欲培养的物品放在指八、实验完毕，整理桌面，将欲培养的物品放在指定地点。值日生打扫卫生，关好水电、门窗，洗定地点。值日生打扫卫生，关好水电、门窗，洗手后离室。手后离室。革兰染色革兰染色（Gram Stain)Gram Stain)nGram StainGram Stain 是由丹麦病理学家是由丹麦病理学家C.GramC.Gram于于18841884年首次使用的细菌染色法，后经年首次使用的细菌染色法，后经过改良并以他的名字命名。过改良并以他的名字命名。n革兰氏染液

4、：结晶紫、卢戈碘液、革兰氏染液：结晶紫、卢戈碘液、9595乙醇、稀释石炭酸复红染液乙醇、稀释石炭酸复红染液实验目的实验目的1.1.掌握细菌涂片标本的制备及革兰氏染色掌握细菌涂片标本的制备及革兰氏染色法。法。2.2.掌握无菌操作技术。掌握无菌操作技术。3.3.熟悉革兰氏染色法在鉴定细菌上的重要熟悉革兰氏染色法在鉴定细菌上的重要意义意义。实验原理实验原理n三种假说三种假说1.1.等电点学说等电点学说 革兰阳性菌等电点（革兰阳性菌等电点（pI pI ：PH 2-3PH 2-3）比革）比革兰阴性菌（兰阴性菌（pIpI： PH 4-5PH 4-5）低，在相同）低，在相同pHpH条件下，革兰条件下，革兰阳

5、性菌所带负电荷比革兰阴性菌多，故与带正电荷的结阳性菌所带负电荷比革兰阴性菌多，故与带正电荷的结晶紫染料结合牢固，不易脱色。晶紫染料结合牢固，不易脱色。2. 2. 化学学说化学学说 革兰阳性菌菌体含大量核糖核酸镁盐，可革兰阳性菌菌体含大量核糖核酸镁盐，可与碘、结晶紫牢固结合，使已着色的细菌不被乙醇脱色；与碘、结晶紫牢固结合，使已着色的细菌不被乙醇脱色；革兰阴性菌菌体含核糖核酸镁盐很少，故易被脱色。革兰阴性菌菌体含核糖核酸镁盐很少，故易被脱色。3.3.通透性学说通透性学说 革兰阳性菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层革兰阳性菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易透入；革兰阴性菌细胞壁结厚，脂

6、质含量少，乙醇不易透入；革兰阴性菌细胞壁结构疏，肽聚糖层薄，含大量脂质，乙醇易渗入。构疏，肽聚糖层薄，含大量脂质，乙醇易渗入。意义：意义：1.革兰染色法可以观察细菌的形态和排列，根据染革兰染色法可以观察细菌的形态和排列，根据染色结果将所有细菌分成色结果将所有细菌分成革兰阳性菌革兰阳性菌与与革兰阴性菌革兰阴性菌两大类：两大类：不被酒精脱色仍保留紫色者为革兰阳性不被酒精脱色仍保留紫色者为革兰阳性菌（菌（G+菌），被酒精脱色后复染成红色者为革兰菌），被酒精脱色后复染成红色者为革兰阴性菌（阴性菌（G-菌）菌）。n2.革兰染色法不仅有助于细菌的鉴别，同时还为革兰染色法不仅有助于细菌的鉴别，同时还为分析细

7、菌的致病性分析细菌的致病性 n3.选用抗菌药物提供了依据。选用抗菌药物提供了依据。实验材料实验材料n菌种：菌种：大肠杆菌大肠杆菌181824h24h琼脂斜面培养物、琼脂斜面培养物、葡萄球菌葡萄球菌181824h24h琼脂斜面培养物。琼脂斜面培养物。n试剂：试剂：革兰染色液。革兰染色液。n其他：其他：载玻片、生理盐水、接种环、酒载玻片、生理盐水、接种环、酒精灯等。精灯等。实验步骤实验步骤n细菌涂片标本的制作（涂片、干燥、固定）细菌涂片标本的制作（涂片、干燥、固定）n染色（初染、媒染、脱色、复染）染色（初染、媒染、脱色、复染）n镜检镜检【实验方法】【实验方法】染色染色涂片涂片干燥干燥固定固定镜检镜

8、检 初染、媒染、初染、媒染、脱色、复染脱色、复染取取洁净的洁净的载玻片一张载玻片一张滴一小滴滴一小滴生理盐水生理盐水于载玻片中央于载玻片中央接种环在酒精灯火焰上烧灼灭菌接种环在酒精灯火焰上烧灼灭菌、冷却冷却无菌操作无菌操作从琼脂斜面上沾取从琼脂斜面上沾取少许菌苔少许菌苔混入载玻片上的生理混入载玻片上的生理盐水中盐水中磨匀并涂抹成直径磨匀并涂抹成直径1cm1cm1.5cm1.5cm左右的左右的均匀薄层均匀薄层菌膜菌膜自然干燥；或将自然干燥；或将涂有细菌的一面朝上涂有细菌的一面朝上，在酒精灯火焰上方烘干，在酒精灯火焰上方烘干 手持载玻片一端，涂有细菌标本的一面朝上，将载玻片在酒精灯手持载玻片一端，

9、涂有细菌标本的一面朝上，将载玻片在酒精灯火焰外层火焰外层（最（最热部分热部分) )来回来回快速通过快速通过3 3次次，使涂抹的细菌固定于载玻片上，使涂抹的细菌固定于载玻片上 滴加稀释滴加稀释石炭酸复红石炭酸复红染液，染液，30s30s1min1min后水洗，用吸水纸吸干后水洗，用吸水纸吸干用油镜观察，并判断菌体的染色反应性。记录实验结果用油镜观察，并判断菌体的染色反应性。记录实验结果加加95%95%乙醇乙醇数滴于标本片上，频频摇晃数滴于标本片上，频频摇晃3 35s5s后，斜持玻片使乙醇流掉，后，斜持玻片使乙醇流掉，再滴加乙醇直至无紫色脱下为止（再滴加乙醇直至无紫色脱下为止（约约30s30s），

10、水洗），水洗 ，甩去标本片上的积水，甩去标本片上的积水 滴加滴加卢戈碘液卢戈碘液，1min 1min 后水洗，并将标本片上的积水甩净后水洗，并将标本片上的积水甩净 将玻片置于染色架上，滴加将玻片置于染色架上，滴加结晶紫结晶紫染液染液2 23 3滴于标本片上（涂片两端同时滴于标本片上（涂片两端同时进行，以下同），进行，以下同）， 1min1min后水洗，并将标本片上的积水甩净后水洗，并将标本片上的积水甩净 初染初染（1min)媒染媒染(1min)脱色脱色(30s)复染复染(30s)实验结果实验结果n革兰阳性菌革兰阳性菌被结晶紫着色后不易被酒精脱被结晶紫着色后不易被酒精脱色，故染成色，故染成紫色，

11、紫色，如葡萄球菌；如葡萄球菌；n革兰阴性菌革兰阴性菌被结晶紫着色后易被酒精脱色，被结晶紫着色后易被酒精脱色，故被稀释故被稀释石炭酸复红石炭酸复红复染成复染成红色，红色，如大肠如大肠杆菌。杆菌。 葡萄球菌葡萄球菌大肠杆菌大肠杆菌注意事项注意事项1. 标本涂片不能涂的太薄或太厚，以免影响结果。标本涂片不能涂的太薄或太厚，以免影响结果。2. 革兰染色成败的关键在于革兰染色成败的关键在于脱色时间脱色时间。如脱色过度，。如脱色过度， 革兰阳性菌也可被脱色而被误认为是革兰阴性菌；如革兰阳性菌也可被脱色而被误认为是革兰阴性菌；如脱色时间过短，革兰阴性菌也会被认为革兰阳性菌。脱色时间过短，革兰阴性菌也会被认为革兰阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄、脱色时玻片晃动的快脱色时间的长短还受涂片厚薄、脱色时玻片晃动的快慢及乙醇用量多少等因素影响，难以严格规定。慢及乙醇用量多少等因素影响，难以严格规定。3. 染色过程中勿使染色液干涸，用水冲洗后，应甩去玻染色过程中勿使染色液干涸，用水冲洗后，应甩去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。片