坦布苏病毒简介

1、坦布苏病毒简介1、坦布苏病毒病概述2021年4月以来在我国大局部养鸭地区发生了一种以传播迅速、突发性的产蛋急剧下降为主要特点的新鸭病.临床主要表现为：产蛋鸭产蛋严重下降,产蛋率从90%降至10%以内,甚至绝产,给养鸭业造成了严重的经济损失(李玉峰,2021).该病最初命名为“鸭出血性卵巢炎,“鸭病毒性脑炎,“鸭产蛋下降综合症,“鸭传染性卵巢炎(黄欣,2021;李玉峰,2021;廖敏等,2021)等.苏敬良等从病鸭中别离出了一种新型黄病毒,并 命名为BYD病毒,属于在鸭上首次发现.2021年该病被确诊是鸭坦布苏病毒 (DuckTembusuvirus, DTMUV).到目前为止,更有报道本病在蛋

2、鸡、鸡群及鹅群 (傅光华等, 2021;黄欣梅,2021)中发现.关于本次在鸭上传播的鸭黄病毒,病毒学家,法国马赛第二 大学的访问学者ErnestGould表示,由蚊子造成的传播不应该是一种必然的结果,并指出这种病毒传播期间的温度变化与由蚊子传播的其他黄病毒并不一致.(鸭子在早春的严寒气 候中开始患病,而推测起来,蚊子种群在此时还很虚弱,而疾病的爆发那么会一直持续到秋 季.)鉴于该病为鸭群新发生的疫病,除该病的病原学外,其致病机理、免疫机理、快速诊 断技术和防制举措等,都有待进一步深入研究.2、病原学鸭出血性卵巢炎的病原与恩他耶病毒群的坦布苏病毒(Tem-busuvirus, TMUV)印尼和

3、泰国病毒株的核甘酸同源性为87%91%,氨基酸同源性为98%99%;而与同群的Ntaya病 毒、Sitiawan 病毒、Theiler'smurineencephalomye-litisvirus(TMEV Bagaza病毒的核甘酸同 源性大于70%,国际上对黄病毒属成员的分类标准为NS5基因3'端长约1kb的区域中同种病毒的核甘酸序列同源性大于84%.因此确定该病原为黄病毒科黄病毒属恩他耶病毒群的TMUVo 鸭坦布苏病毒(DuckTembusuvirus, DTMUV)属于黄病毒科(Flaviviridae)、黄病 毒属(Flavivirus).TMUV的病毒粒子直径 405

4、0nm,有脂质囊膜(胡旭东等,2021). 病毒基因组为单股正链RNA,大小为.病毒基因组结构鸭坦布苏病毒基因组为不分节段的单股正链 RNA,分子量约为X 106(Shustov,AVetal.,2007)由 10990 个核甘酸构成(Yun,Tetal.,2021)=病毒基因组由 3'非编 码区(3' untranslatedregion , UTR) , 5'非编码区(5' non-codingregion, NCR 及一个开放性阅读框openreadingframe, ORF组成.3'非编码区由618个核甘酸构成,与其 他黄病毒不同,3非编码区还含

5、有一个 poly A尾,包括起始、调节基因组复制和转录 的保守二级或三级RNA元件.5'非编码区由94个核甘酸构成,在黄病毒属中该结构保守 性较差,其主要功能是在 RNA复制过程中作为正链合成的起始位点.病毒基因组的开放性 阅读框ORF包含10230nt,编码一个大多聚蛋白,由3426个氨基酸构成,可以裂解为3 个结构蛋白C、M、E蛋白和7个非结构蛋白NS1, NS2A, NS2B NS3, NS4A NS4B NS5Mukhopadhyay,Setal.,2005> E、NS1、NS3 NS5蛋白具有保守性和抗原性. C蛋白的 氨基酸同源性低,含有大量的碱性氨基酸,参与病毒组装

6、过程.E蛋白是DFV主要外表蛋白,具有促使病毒与宿主细胞结合及膜融合功能,能诱导产生中和抗体.DFV的非结构蛋白NS1是黄病毒中最大的,是病毒感染过程中产生的主要免疫原,但NS1免疫不能诱导无明显的抗病毒抗体产生,发生抗体增强效应的可能性较小TangY, etal.,2021.NS3蛋白具有丝氨酸蛋白酶、核甘三磷酸酶/RNA解旋酶活性,参与蛋白质水解加工及病毒复制,与病 毒的致病性密切相关郑杰,2007.NS3与NS2组成病毒复制体,感染动物可产生抗 NS2-3 抗体,但抗NS2-3抗体不具有病毒中和活性郑杰,2007.基因组RNA就是DTMUV特异性 RNA,具有感染性、携带全部遗产信息、在

7、病毒增殖过程中,直接起 mRNA作用,既可复 制子代RNA,又可译出病毒蛋白.生物学特性TMUV对乙醴及去氧胆酸盐敏感.56c加热15分钟灭活.最适pH为,pH10以上使其 灭活.对酸敏感.TMUV在胰酶处理后,感染性丧失.鸭坦布苏病毒可以在鸭胚、鸡胚、 鸭胚成纤维细胞及局部传代细胞系如 Vero细胞中繁殖.将鸭坦布苏病毒经尿囊腔接种鸡胚 和鸭胚,3-5d后可致鸡胚和鸭胚死亡.接种 CEFW彳5代不会产生病变,而将鸭源胚毒第 1代接种DEF就在48h出现了明显CPE适应DEF后的病毒,通常在36-48h就会产生CPE 随时间延长,CPE会更加明显,表现为细胞圆缩和脱落,细胞折光性增强,细胞变圆

8、以及 细胞融合,最终崩解死亡.通过.染色便可见细胞破碎,并有大量红染颗粒.通过 RT-PCR 检测,接种病毒的CEF为阴性,而接种DEF后检测为阳性李玉峰等,2021.3鸭坦布苏病毒的研究现状1997年,温立斌等温立斌,2001从石家庄、邢台、邯郸等地发现康贝尔鸭产蛋下降, 有神经病症,别离到有囊膜 RNA病毒,经初步鉴定,疑似黄病毒,初步命名为“鸭病毒性 脑炎.曹贞贞等曹贞贞,2021于2021年将种鸭和蛋鸭发病死亡病例暂命名为“鸭出血 性卵巢炎.2021年,苏敬良、高福等苏敬良等,2021经过大量的研究工作,测序分析 将其命名为白洋淀BYD病毒.李玉峰等李玉峰,2021发现,除种鸭外,商品

9、肉鸭也发 病.黄欣梅等黄欣梅,2021报道鸭鹅均发病,将其命名为“脑炎-卵巢炎综合征.随后, 傅光华等傅光华等,2021;黄欣梅,2021报道本病在蛋鸡、鸡群中发现.截至2021年12月15日,GenBank数据库收录了 9株鸭源、1株鹅源、1株鸡源共11 株DTMUV的基因序列.GenBankYY5株(HQ641390.1)鸭BYD-1 株(JF312912.1)鸭duck/SD/CHN/2021株(JF738022.1)鸭Fengxian 株(HQ833331.1)鸭Huabei 株(JF523187.1)鸭CJD05/CHN/2021株(JF795477.1)鸭HBJL 株(JF4231

10、23.1)鸭JS804 株(NC015843.1)鹅JM株(JN811559.1)鸭FS株(JN811558.1)鸭muscovy/SD/China/2021(JN232077.1)鸭11株鸭坦布苏病毒的多聚蛋白、NS5 E基因核甘酸序列同源性均大于 98%.其中BYD-1、 JS804 FS JM、muscovy/SD/China/2021、CJD05I? 6株病毒完成了全基因组或聚蛋白基因 序列分析.E基因遗传进化分析发现,11株鸭坦布苏病毒分属于2个分支,其中CJD05 Fengxian JS804 muscovy/SD/China/2021等4株的亲缘关系相近,与泰国蚊源株 THCar

11、同 属一个分支；而 BYD-1、FS JM、duck/SD/CHN/2021等4株的亲缘关系相近,属于另一个 分支.NS5基因遗传进化分析结果说明,11株DFV分属于2个分支,其中Huabei与其它 10株亲缘关系较远,与 TembusuvirusnoteN2revived14/6/82同属一个分支；而其它 10株的 亲缘关系相近,与泰国蚊源株 THCar同属于一个分支.NS5和E基因进化分析结果提示我 国的DFV源头可能来东南亚,而不同地区流行病毒株存在遗传变异情况李玉山I, 2021.4流行特点鸭坦布苏病毒在自然爆发时可感染除番鸭外的所有品种产蛋鸭,包括蛋鸭如金定鸭、绍兴鸭、山麻鸭、缙云麻

12、鸭、台湾白改鸭、康贝尔鸭卜肉种鸭如北京鸭和樱桃谷鸭及野鸭等滕巧泱等,2021.也有相关报道产蛋鸡傅光华、陈仕龙等,2021、鹅自然感染发 病黄欣梅,2021.在病毒的复制研究中,也有相关报道称人工肌肉注射或滴鼻接种别离的 病毒在雏鸭、雏鸡、蛋鸭、雏鹅中成功复制出该病并回收到病毒李玉峰等,2021;廖敏等,2021；曹贞贞,2021； SuJing-liangandHuXu-dong 2021；黄欣梅,2021.到目前为止,有相关领域的研究人员从泄殖腔棉拭子中别离到病毒,说明该病毒可经 粪便排毒；另一方面,相关领域的研究人员从鸭场内死亡麻雀体内检出鸭坦布苏病毒,提 示病毒可经鸟类传播；带毒蚊子和

13、麻雀可导致病原在不同鸭场间的传播.在病鸭组织样品 中进行病毒别离,卵泡膜的检出率最高,达 93%,近期该病毒在种鸭和种鹅上的垂直传播 也有报道.5诊断目前可用于鸭坦布苏病毒病原别离与鉴定的方法主要有SPF鸡胚和鸭胚病原别离法(Cao,Zetal.,2021)常规 RT-PCR检测方法(Yan,Petal.,2021) 一步法 RT-PCR检测方法(张帅 等,2021)、套式 PC谕测方法(颜丕熙等,2021)、Real-timeRT-PC检测方法(Yan,Letal.,2021) 一步法 Real-timeRT-PC谕测方法(Yun,Tetal.,2021 RT-LAMP检测方法(Tang,Y

14、etal.,2021)口 间接ELISAt(姬希文等,2021)等.实验室诊断鉴于对鸭坦布苏病毒病的研究还不够深入,目前实验室用于检测鸭坦布苏病毒病的病 原的方法不是很多,但是每一种都有自身的优缺点.常规的检测方法主要是血清学方法, 包括中和试验、血凝试验、琼脂免疫扩散试验、荧光抗体技术、酶联免疫吸附试验以及分 子生物学实验等.血清中和试验(Virus-neutralizationtest,VN)中和试验是目前最常用、最可靠的方法,是公认的一种权威方法.通常在鸡胚上以固 定血清-稀释病毒法进行,也有人在鸭胚、雏鸭或病毒适应细胞中进行试验.就目前而言, 此病的中和试验的孵育温度、病毒量等的最正确

15、条件的研究,还未见报道.利用中和抗体进 行的空斑减少试验,微量中和试验也未见报道.中和试验虽是普遍认为的权威诊断方法, 但其繁琐、费时、本钱高,不能用于快速诊断,难以在基层中推广应用.在诊断其他鸭病 上被认为是一种最可靠的方法,但用该方法诊断鸭坦布苏病毒病的研究还未见报道,相信 在不久的时间内该方法的研究报道将接踵而来.酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)当前酶免疫测定技术中 应用最广泛的技术,姬希文等(姬希文等,2021)首次建立了间接ELISAt以检测鸭坦布苏病 毒(DTV)抗体,利用纯化的DTV奉贤株(FX2021

16、)乍为包被抗原,建立了检测 DTV血清抗体 的间接ELISAT法,并且对各种检测条件进行了优化.优化后确定的抗原最适包被浓度为小g/孔,抗原最正确包被条件为37c放置2h后,4c下过夜,血清的最正确稀释度为1 : 200,酶 标二抗的最正确作用时间为45min,酶标抗体最适稀释度为1 : 2000.在优化条件下,阴阳性 临界值判定标准为.用建立的间接ELISAT法对禽流感病毒、新城疫病毒、网状内皮增生病 病毒、I型鸭肝炎病毒、呼肠孤病毒、禽白血病病毒阳性血清进行了检测,均无交叉反响, 说明该方法具有良好的特异性.批内和批间重复试验的最大变异系数分别为麻口,显示该方法具有很好的稳定性.用间接 E

17、LISA方法对140份疑似鸭坦布苏病血清样品进行检测, 有108份样品呈现阳性,而琼扩试验只有32份呈阳性结果,而且用该方法检测的阳性样品 包括了琼扩试验的阳性样品,证实该方法具有较高的敏感性和特异性.间接ELISAT法虽然具有灵敏度高,操作简便、特异性强的优点,很多学者也建立了用 以诊断DTV的这种方法,但因所用的检测试剂包被液、封闭液、酶标抗体等尚未标准 化,病毒的纯化和DTV阴性血清的制备等均存在一定难度,该方法在鸭坦布苏病毒的检测 诊断方面还未能彳#到广泛的应用姬希文等,2021.分子生物学实验近两年来,随着分子生物学技术的飞速开展,专家学者对鸭坦布苏病毒的研究不断地 深入,已经建立起

18、检测鸭坦布苏病毒的分子生物学方法.曹贞贞、张存等在对不同地区的 15份样品进行病毒别离后,RT-PCR佥测结果显示禽流感、鸭瘟病毒、水禽细小病毒、鸭呼 肠孤病毒、鸭甲肝病毒、鸭形状病毒、鸭圆环病毒、鸭冠状病毒、鸡传染性支气管炎呈阴 性,15份样品中,1份样品新城疫病毒阳性,为自然病例的混合感染现象；仅黄病毒RT-PCR 检测呈阳性.这对于鸭坦布苏病毒的准确分类以及建立快捷的诊断方法奠定了根底曹贞 贞等,2021.颜丕熙等根据鸭坦布苏病毒 E基因序列,设计了 2对重叠引物,建立了检测鸭坦布苏 病毒的套式RT-PC时法,该套式RT-PCR匕一般PCR敏感性高10倍,且具有良好的特异性. 应用该套式

19、RT-PCR寸临床病料进行检测验证,结果说明该套式RT-PCR1检测鸭坦布苏病毒的有效手段,可用于鸭坦布苏病毒的临床诊断和分子流行病学调查.采用该方法对安徽 省、河北省、山东省、浙江省、上海市等地发病鸭场的63份样品进行了检测,阳性检出率为48/63 %,而病毒别离率仅为13/63 %.由此说明,与其他方法相比拟,所建立 的套式RT-PC时法具有快速、敏感、特异优点,可用于鸭坦布苏病毒的流行病学调查及病 毒的木测颜丕熙,2021.云涛等建立的一步法实时荧光定量 RT-PCR佥测方法,利用MGB探针,在3'非编码区 设计一对引物和探针,最低能检出 10Copies L的体外转录RNA量,在保证快速、准确、特异的根底上,大大提升了检测的敏感性,有利于,为鸭坦布苏病毒病的疫病监测和限制 提供技术支持(云涛等,2021) o王友令等以新别