实验一原核生物基因组DNA的制备

1、实验一实验一原核生物原核生物基因组基因组DNA的制备的制备 一、实验目的一、实验目的v掌握从细菌中提取基因组掌握从细菌中提取基因组DNA的基本原理的基本原理v熟悉利用试剂盒提取细菌熟悉利用试剂盒提取细菌DNA的技术流程的技术流程v提取卡介苗提取卡介苗BCG基因组基因组DNA二、实验原理二、实验原理v裂解细胞裂解细胞v除去蛋白质除去蛋白质v析出析出DNAvCTAB(cetyltriethylammonium bromide，十六烷，十六烷基三乙基溴化铵基三乙基溴化铵)是一种去污剂，它能与核酸形成复是一种去污剂，它能与核酸形成复合物，这些复合物在高盐溶液合物，这些复合物在高盐溶液(0.7mol/l

2、 NaCl)中可中可溶并且稳定存在。此时的高盐溶液中除含有溶并且稳定存在。此时的高盐溶液中除含有CTAB-核酸复合物外，还含有大量的多糖和蛋白。核酸复合物外，还含有大量的多糖和蛋白。核酸提纯核酸提纯v(1) 用氯仿先对此高盐溶液进行抽提，大量蛋白和用氯仿先对此高盐溶液进行抽提，大量蛋白和多糖等被从溶液中抽提沉淀出来，而核酸仍留在溶多糖等被从溶液中抽提沉淀出来，而核酸仍留在溶液中；接着可用乙醇或异丙醇将核酸从溶液中沉淀液中；接着可用乙醇或异丙醇将核酸从溶液中沉淀出来，然后用水或出来，然后用水或TE缓冲液等将核酸溶解。缓冲液等将核酸溶解。v(2) 降低溶液中盐的浓度降低溶液中盐的浓度(0.3mol

3、/l NaCl)，CTAB与与核酸的复合物就会因溶解度降低而沉淀出来，而大核酸的复合物就会因溶解度降低而沉淀出来，而大部分的蛋白及多糖仍溶于溶液中；通过离心将部分的蛋白及多糖仍溶于溶液中；通过离心将CTAB-核酸沉淀下来，然后溶解于高盐溶液中。通核酸沉淀下来，然后溶解于高盐溶液中。通过氯仿抽提或过氯仿抽提或CsCl离心等方法去除核酸溶液中所有离心等方法去除核酸溶液中所有的蛋白和多糖等不纯物，并用核糖核酸酶的蛋白和多糖等不纯物，并用核糖核酸酶(RNase)酶解去除酶解去除RNA。三、实验材料三、实验材料v卡介苗卡介苗BCGv细菌基因组细菌基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）提取试剂盒（离心柱型）D

4、P302v水浴锅、离心机、移液器水浴锅、离心机、移液器v试剂盒采用可以特异性结合试剂盒采用可以特异性结合DNA的离心吸附柱和独的离心吸附柱和独特的缓冲液系统提取细菌基因组特的缓冲液系统提取细菌基因组DNA。v离心吸附柱中采用的硅基质材料为特有新型材料，离心吸附柱中采用的硅基质材料为特有新型材料，可高效、专一吸附可高效、专一吸附DNA，最大限度去除杂质蛋白及，最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。细胞中其他有机化合物。v回收的回收的DNA可适用于各种常规操作，包括酶切、可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、文库构建等实验。、文库构建等实验。四、注意事项四、注意事项v实验中所有的废弃物均要

5、高压灭菌。实验中所有的废弃物均要高压灭菌。五、实验步骤五、实验步骤（1）取细菌培养液）取细菌培养液1-5ml，10,000rpm，1min，尽量，尽量吸净上清。吸净上清。（2）沉淀中加入）沉淀中加入180l溶菌酶溶液（溶菌酶溶液（20mg/ml），），37，60min。（3）加入）加入20l蛋白酶蛋白酶K溶液，混匀。溶液，混匀。（4）加入）加入220l缓冲液缓冲液GB，振荡，振荡15s，70，10min，溶液变澄清溶液变澄清。瞬时离心以去除管盖内壁的水珠。瞬时离心以去除管盖内壁的水珠。（5）加入）加入220l无水乙醇，充分振荡无水乙醇，充分振荡15s，此时可，此时可能会出现絮状沉淀，瞬时离心以

6、去除管盖内壁的能会出现絮状沉淀，瞬时离心以去除管盖内壁的水珠。水珠。（6）将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附）将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱柱CB3中（吸附柱放入收集管中），中（吸附柱放入收集管中），12,000rpm，30s，弃废液，将吸附柱，弃废液，将吸附柱CB3放入收集管中。放入收集管中。（7）向吸附柱）向吸附柱CB3中加入中加入500l缓冲液缓冲液GD，12,000rpm，30s，弃废液，将吸附柱，弃废液，将吸附柱CB3放入收放入收集管中。集管中。（8）向吸附柱）向吸附柱CB3中加入中加入600l漂洗液漂洗液PW，12,000rpm，30s，弃废液，将吸附柱，弃废液，

7、将吸附柱CB3放入收放入收集管中。集管中。（9）重复步骤）重复步骤。（10）将吸附柱）将吸附柱CB3放回收集管中，放回收集管中，12,000rpm，2min，弃废液。将吸附柱，弃废液。将吸附柱CB3室温放置数分钟，室温放置数分钟，以以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。（11）吸附柱）吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加膜的中间部位悬空滴加50-200l洗脱缓冲液洗脱缓冲液TE，室温放置室温放置2-5min，12,000rpm，2min，将溶液收，将溶液收集到离心管中。（为增加基因组集到离心管中。（为增加基因组DNA的得率，可将的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置中，室温放置2min，12,000rpm，2min）五、结果检测五、结果检测v紫外吸收法检测所提取基因组紫外吸收法检测所提取基因组DNA的浓度与纯度；的浓度与纯度；v取少量取少量DNA溶液在溶液在0.8%的琼脂糖凝胶上电泳分离的琼脂糖凝胶上电泳分离并在核酸紫外检测仪上观察。并在核酸紫外检测仪上观察。少量少量DNA溶液在溶液在0.8%的琼脂糖凝胶上电的琼脂糖凝胶上电泳分离图片泳分离图片六.思考题（1）操作第（）操作第（4）步骤的时候溶液是否变得清亮？）步骤的时候溶液是否变得清亮？如果没有