细胞自噬检测

1、细胞从培养皿上被刮下来之后，在 15ml灭菌塑料试管中用PBS洗涤3次，每次 洗涤用lOmIPBs充分重悬细胞，在4 “c下5009离心5min。所有操作在冰上进 行。最后一步洗涤把细胞转移到管中。 把细胞充分重悬在TAP细胞裂解液中。根 据细胞量决定裂解缓冲液的体积（一般每10川细胞用100川一 200川TAPBU介 r）。放置于冰上30min,每10min用移液枪吹打细胞一次使之充分悬浮。在 4OC 下用100009高速离心15min,把上清转移到新的试管中进行下一步实验，丢弃 沉淀。细胞自噬活性的检测 我们主要通过两条途径来诱导细胞发生自噬，一饥饿处理，二药物 RaPamycin 处理。

2、对 于饥饿处理，吸去正常培养的细胞中的培养液，用PBS小心洗涤细胞三次，注意不要使细胞脱离培养皿，加入15mIEBss（用量根据培养皿的大小而定 ）连同2林M的ED64和pePstatin。 在37 “C培养箱中培养2 一 4h。对于RaPamycin处理，在普通细胞培养液中加入终浓度为 500nM的R叩amyein（sigma）37 “e下培养12h。细胞自噬活性的检测主要有两条途径，一 条是通过转染 GFP 一 LC3,再用荧光显微镜观察LC3在细胞质中的聚集。二是用westemblotting 和LC3的抗体，检测细胞内源 LC3n的增加。对于荧光显微镜分析， 在U20S细胞中转染GFP

3、一 LC3, 24h之后，把细胞继代培养在有盖玻 片的6孔板中，诱导自噬，吸去培养液，用PBS小心润洗玻片1次,在每个孔内加入 3%的多聚甲醛，在室温下闭光摇晃培养玻片20min。用PBS洗涤玻片3次，每次每孔加2mlPBS在室温下摇晃10min，用 固定液把盖玻片固定在载玻片上，在室温下干燥1min之后用荧光显微镜观察。 对于 westemblotting ，从培养皿上收集药物或饥饿处理之后的细胞，加入1 SDS蛋白上样缓冲液，并用超声波处理直到不粘稠为止， 95 “e 煮沸样品5min，室温下自噬体检测实验分为3组，分别为自噬诱导组，自噬抑制组和雷帕霉素组。自噬诱导组：1X 105细胞培养

4、至对数生长期,加入50 nmol/L雷帕霉素作用3h,然后按感染复数（MO）=1 : 10比 例加入1X 109 CFU/L的H37RV菌株培养3h, PBS （）缓冲液洗脱3次以洗脱未结合的 H37Rv 菌株。自噬抑制组：细胞加入自噬抑制剂3MA（600 mg/L ）作用36 h,然后按MOI=1： 10比 例接种H37Rv菌株作用3h。雷帕霉素组：细胞培养至对数生长期，加入50 nmol/L雷帕霉素 作用3h。上述各组细胞胰酶消化后收集，20 g/L 锇酸固定过夜，透射电镜观察自噬体的形成。菌落形成单位（CFU检测自噬诱导组和自噬抑制组细胞胰酶消化后收集，加入2倍体积双蒸水裂解细胞，7 0

5、00r/min离心，收集沉淀，重悬后1 : 107稀释，取100 L悬液接种于7H10培养基,37 C培养 21 d进行菌落计数。2结果自噬体检测雷帕霉素作用于细胞后，以H37RV菌株感染细胞，透射电镜可发现细胞中有大量由单层膜组成的自噬囊泡出现，同样雷帕霉素组也可诱导产生自噬体形成。而以自噬抑制剂3 MA处理后，细胞中未发现自噬囊泡（图 1）。CFU检测H37RV菌株感染细胞后裂解，稀释后接种于7H10培养基，经过21 d培养,计数CFU自 噬诱导组H37RV菌株CFU为土，而3MA处理后CFU为土 ,两组相比有统计学意义（P）。这 些结果说明自噬体产生后可对胞内感染的H37RV菌株有一定的

6、清除作用。1. 3免疫荧光法观察长春瑞滨给药后 A549细胞内LC3蛋白表达的变化A549细胞接种于多聚赖氨酸处理的盖玻片于 6孔板中，待细胞贴壁后 加入一定浓度的长春瑞滨同时设立阴性对照和空白对照，培养不同时间（O一24）h后，于盖玻片上4%多聚甲醛固定细胞15 min，固定的细 胞用PBS两次后，加入0. 25 % Trit on X100冰上放置5 min , PBS洗2次，然后加入1 %牛血清白蛋白(bovine serum albumin , BSA)处 理30 min，加入 I % BSA稀释的羊抗人 MAPLLC；一 11(1 : 200), 4 oC 孵育过夜，次日用PB號3次

7、后，加儿FITC标记的兔抗羊lgG(1 %BSA 以I : 20的比例稀释)，室温下避光孵育30 min, PBS!次洗涤细胞后， 用10 - g/mLPI和RnaseA室温下细胞核DNAfe色30rain，激光共聚焦 显微镜下观察。1. 4 LC3免疫荧光染色后流式细胞仪对细胞自噬进行定量检测按上述1. 3方法收集细胞(同时设立空白对照及阴性对照组 )后用4C预冷的PBS洗2遍，然后用4%不含甲醇的甲醛冰上固 定细胞2次后，PBS洗2次，80%冰乙醇固定，置一 20C冰箱过夜，固定的细胞用 PBS洗2次， 然后加入I % BSAI00 IX L重悬细胞，加入I % BSA稀释的兔抗人 MA

8、LC3- 11(1 : 100) , 4 oC 孵育过夜。次Et细胞用PB就3次后，加入F11'C标记的羊抗兔IgG(I % BSA以 1 : 20的比例稀释)， 室温下避光孵育30 min, PBS?次洗涤细胞，流式细胞仪检测LC3荧光水平的变化，反应自噬的比率。平衡盐溶液配制平衡盐溶液是由 Ringer 根据生理盐水首先创制的,由无机盐和添加成分葡萄糖等组成。平 衡盐溶液是为了使哺乳动物细胞短期处于存活状态, 而不是促进其生长。 平衡盐溶液是用来 洗涤组织和细胞，稀释作用于细胞的试剂和药物等，维持生理的pH和渗透压。1 . Hank's 平衡盐溶液Hank's 平衡

9、盐溶液是含磷酸盐的缓冲溶液,在暴露于空气的状态下,能够维持生理的pH。因此,经常作为酶消化细胞或组织和最终将细胞置于培养基中之前的洗涤细胞过程的首选溶液。Hank's 平衡盐溶液配方 Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)组分 分子量 浓度 (gm/L) 摩尔浓度 (mM)无机盐: 氯化钾 (KCl) 75磷酸二氢钾 (KH2PO4) 136碳酸氢钠 (NaHCO3) 84 4氯化钠 (NaCl) 58 8 138磷酸氢二钠 (Na2HPO4) 142其它组分：葡萄糖 (Glucose) 180 1酚红 (Phenol Red) 3982磷酸盐缓冲溶液Dulbecco's 磷酸盐缓冲溶液配方 Du