SDS-PAGE蛋白电泳方法

1、SDS-PAGE一 . 实验原理SDS是一种阴离子表面活性剂，在蛋白质溶液里加入SDS和琉基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原， SDS 能使蛋白质的氢键、疏水键打开并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS复合物。在一定条件下，SDS与大多数蛋白质的结合比例为1.4:1。由于十二烷基磺酸根带负电，使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。 SDS与蛋白质结合后，还 引起了蛋白质构象的改变。蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的 S

2、DS复合物的短轴长度都一样，约为 1.8nm ，而长轴则随蛋白质的 Mr 成正比的变化。基于上述原因，蛋白质-SDS复合物在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与椭圆棒的长度有关， 也就是蛋白质Mr 的函数。二 . 试剂器材30%凝胶贮液(100mL):称取试剂Acr 29.2gf口Bis 0.8我于100m成杯中,向烧杯中加入约60mLM蒸水，充分搅拌溶解后加双蒸水定容至100mL,置于棕色瓶内4 贮存，每过1-2个月应重新配制；注意：丙稀酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收， 其作用有积累性，配制时应戴 手套和口罩等。分离胶缓冲液(1.5 mol/L Tris-H

3、Cl , pH 8.8, 100mL):称取Tris 18.2g溶于约80mL双蒸水，用6mol/L的HCl调整pH值至8.8,加双蒸水定容到100mL, 4c 贮存；堆积胶缓冲液(0.5 M Tris-HCl, pH 6.8, 100mL):称取 Tris 6.0g容于约 80mLM 蒸水，用1mol/L的HCl调整pH值至6.8,加双蒸水定容到100mL, 4c 贮存；电泳缓冲液（1L）:称取试剂Tris 3.03剂甘氨酸14.4负于500m成杯中，向烧杯 中加入约400mLM蒸水充分溶解，再加入10%SDS液1.0mL,以双蒸水定容至 1L （自然pH值为8.3,无需再调），4c贮存，可

4、重复使用5-欹；2刈口样缓冲液（10mL）:取下列试剂置于10mL塑料离心管中0.5mol/L Tris-HCl 缓冲液(pH6.8)2.0mL10%SDS 液4.0mL甘油2.0mL筑基乙醇2.0mL澳酚蓝0.02 g混匀后1mL分装,-70 C可贮存6个月；10%AP:称取（NH4）2$O31.0 g,溶于10.0mLM蒸水中，分装成每份1mL, -20c贮存；TEMED:分装成每份1mL, 4c避光贮存；水饱和正丁醇（100mL）:在玻璃瓶中加入50mLM蒸水和50mL正丁醇，振摇。上 层相即水饱和正丁醇，室温下可长期保存。染色液（100mL）:称取考马斯亮蓝R-250 0.25g加入双

5、蒸水40.0mL、甲醇50.0mL和乙酸10.0mL,搅拌溶解后滤纸过滤除去不溶颗粒；脱色液（1L）:分别取甲醇50mL和乙酸75mL,加双蒸水875mL稀释。其他器材：容量瓶（1L、100mk 10ml）、烧杯、离心管（15mk 1.5ml）、移液器、移液 器吸头、干燥器、涡旋振荡器和废液缸等。分离胶配方（100mL , 4块胶）贮液分离胶中丙烯酰胺的终浓度（）8.09.010.011.012.013.014.015.016.017.018.0凝胶贮液(mL)26.6730.0033.3336.6740.0043.3346.6750.0053.3356.6760.00分离胶缓冲液(mL)25

6、双蒸水(mL)46.5343.2039.8736.5333.2029.8726.5323.2019.8716.5313.2010%SDS (mL)1.010%AP (mL)0.75TEMED (mL)0.05(抽气后添加)堆积胶配方(40mL, 4块胶)贮液一堆积胶中丙烯酰胺的终浓度 ()3.04.05.0凝胶贮液(mL)4.005.366.66分离胶缓冲液(mL)10.0双蒸水(mL)25.3624.0022.7010%SDS(mL)0.410%AP(mL)0.2TEMED(mL)0.04(抽气后添加)三.操作步骤样品处理：在密封的螺盖微量离心管中，用 2刈口样缓冲液按1:1稀释蛋白质样品溶

7、 液，于100c煮沸3-5min,分子质量标准品也经上述处理。凝胶制备：将玻璃板用蒸储水清洗干净，再用 75%的酒精去脂，干燥后固定在灌胶支 架上；配制12%的分离胶，加入TEMED前抽真空10min以除去丙烯酰胺溶液中 的空气；加入TEMED后轻轻振荡混匀，迅速注入安装好的玻璃板的间隙中，给堆积胶留出约 1cm 的空间。在丙烯酰胺溶液上覆盖一层水饱和的正丁醇，以防止空气扩散到凝胶中抑制聚合作用，并保证凝胶表面水平；在室温条件下，凝胶应在 30min-50min 内聚合完成。凝胶聚合后凝胶和上层液相之间可见折射率的变化；倒掉覆盖层并用蒸馏水清洗凝胶顶部数次，并用滤纸条吸净残留的蒸馏水，注意勿破

8、坏凝胶表面；制备堆积胶并迅速注入分离胶上，立即插入干净的梳子，不要混入气泡，以一定的角度将梳子插入堆积胶能减少气泡的产生。堆积胶聚合后小心移去梳子，避免破坏加样孔，用蒸馏水小心清洗加样孔，以除去未聚合的丙烯酰胺。加样：将凝胶固定在电泳装置上，电泳上槽内加入电泳缓冲液没过加样孔，并检查有无渗漏。倾斜整个装置以赶走凝胶下面可能留有的气泡；按预定顺序加样，每孔加入 20 L ，在对照孔中加入分子质量标准品6-7 L ，如有空置的加样孔，加入等体积的1刈口样缓冲液。电泳：将电泳装置与电源相连，正极接下槽、负极接上槽进行电泳，样品在堆积胶阶段电压为80V,而在分离胶阶段电压调整为120V。直到澳酚蓝到达

9、分离胶 的底部后，关闭电源，断开电极。从电泳装置上卸下玻璃板，用小铲子剥下凝胶后切除一角以标注凝胶方位。染色：将凝胶浸泡在染色液中，置于摇床上染色4hr,染色液可回收重复利用。脱色：染色结束后，将凝胶浸泡在脱色液中，置于摇床上脱色过夜，其间更换脱色液 3 次 .记录：将显示蛋白条带的凝胶用凝胶成像仪拍照，记录试验结果，并根据分子质量标准品计算目标蛋白的分子量。四.注意事项：SDS与蛋白质的结合按质量成比例，蛋白质含量不可以超标，否则 SDS结 合量不足。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量时，必须同时作标准 曲线，并且SDS-PAGE测定分子量有10%误差。有些蛋白质由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（a-胰凝乳蛋白酶）组成的， 它们在琉基乙醇和SDS的作用下解离成亚基或多条单肽链。因此，对于这一类 蛋白质，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的只是它们的亚基或是单