RT-PCR详细图文解析

1、一、实时荧光定量 PCR原理(一)定义：在 PC或应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。(二)实时原理1、常规PC破术：对PCRT增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩 增反应实时检测。2、实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCRF增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过 Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析3、如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析.4、几个概念：(1)扩增曲线：横坐标e犷增插环数(Cy'de)；纵坐标上英光强 度每个循环进行一

2、次荧光信号的收集(2) 荧光阈值:荧光信号阈值(threshold > ：前15个福环信号作为荧光本底片号 baseline),即样本的荧光臂景值和SB性对照的荧光值信光域值的疑省设给是3个循环 的荧光信号的标覆偏差的10倍手动设置：晶则要大于样本的荧光背 景值和阴性对照的荚光高值，同时票尽 选择进入指数期的最初阶段，并且保证 回归系数大于。.99J真正的信号:熨光信号超过域值(3) Ct 值:Ct值的定义：PCR扩增过程中.扩增产物的荧光信号达到设定的阑 值时所经过的扩增循环次数CT值的重现性:LXJaxuMf纵轴二美光信号星Cyc lc HumbisrCt值的特点£相同模板

3、进行g骸tn邕 终点处产物量不恒定; ct值则极具重现性5、定量原理:理想的PC阪应:X=X0*2 n非理想的PC阪应:X=Xo (1+Ex) nn:扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量Xo：初始模板量Ex :扩增效率 5、标准曲线4模板DNA量越多.荧光达到域值的循环数越少.即Ct值越小 Log浓度与循环数呈线性关系.通过已知起始拷贝数的标准品 可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模 板量6、绝对定量1)确定未知样品的 C(t)值2)通过标准曲线由未知样品的 C值推算出其初始量7、DNA的荧光标记:非特异性荧光标记:L SYBR Green特异性荧光标记:2、Taq

4、Jlan(RB1凡叩rwProbe Querorw3、Molecular Beacon二、实时荧光定量 PCR的几种方法介绍方法一：SYBR Green 法（一）工作原理1、SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位2、SYBR Green 只有和双链DNA吉合后才发荧光3、变性时，DNA链分开，无荧光4、复性和延伸时，形成双链DNA SYBR Green发荧光，在此阶段采集荧光信号5 mi inn mm irii mu i nin inrrn 3r O1 JU.LL1111L lUlHUJIflJll ILIIU LI.IIII1U.U11 crSG SG SGDNA解链一半时的温度

5、融解曲纥分析,出现杂峰苴他产物出现非特异性焚 光，因此定量不准硝模板DNA量越多，荧光达到 域值的循环数越少oovs2no_u>QqEHLl “一热将温度与荧光强度的变化求导。(-dl/dT)融解曲线分析，单一悔无非特舁性荧光定量淮虢 Log浓度与循环数呈线性关 系，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量PC阪应体系的建立及优化1、SYBR Green使用浓度：太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测2、Primer ：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准3、MgCl2的浓度：可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物4、反应Buffer体系的优化5、反应温度和时间参

6、数：由酶和引物决定6、其他与常规PCR相同(二)应用范围1、起始模板的测定；2、基因型的分析；3、融解曲线分析：可以优化PC或应的条件，对常规 PCR有指导意义，如对 primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。(三)优点及缺点优点：对DNA莫板没有选择性；适用于任何DNA 使用方便；不必设计复杂探针；非常灵敏；便宜。缺点：容易与非特异性双链DNA吉合，产生假阳性；但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件；对引物特异性要求较高。方法二：TaqMan-水解型杂交探针Probe艮 Reporter Quencher*5 '端标记有报告基团(Reporter, R)

7、,如FAM VIC等* *3 '端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)* *探针完整，R所发射的荧光能量被 Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光* *Taq酶有5' 3'外切核酸酶活性，可水解探针（一）工作原理注意：每扩增一条 DN册子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光PC阪应的建立：1、引物、探针的设计：探针Tm为68-70 C , <30 bp, 5 '不能有 G, G可能会淬灭荧光素， 引物尽量靠近探针，扩增片段 <400 bp ,引物Tm为59-60C2、反应参数的确定：一般为：94 C, 10-20S60 C, 30-60S （Taq酶5' 一3'外切核酸酶活性在 60C 最高）也可通过温度梯度优化退火温度72 C, 45 S,3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，彳t号/背景比值的最大值引物浓度：50-