Chapter 9 电泳

1、 电泳电泳(Electrophoresis)(Electrophoresis) 荷电溶质荷电溶质( (电解质电解质) )或粒子在电场作用下发生或粒子在电场作用下发生定向定向泳动泳动的现象，简称的现象，简称EPEP 。 电泳分离电泳分离 利用荷电溶质利用荷电溶质在电场中泳动速度的差别在电场中泳动速度的差别进行分离进行分离的方法。的方法。带电粒子在电场作带电粒子在电场作用下向着与其电性用下向着与其电性相反的电极移动相反的电极移动 共同点：表象上均为溶质移动速度差异而分离共同点：表象上均为溶质移动速度差异而分离不同点：产生溶质移动速度差的原理不同。不同点：产生溶质移动速度差的原理不同。色谱为浓差驱动

2、的传质色谱为浓差驱动的传质平衡分离法平衡分离法电泳是外力电泳是外力( (电场力）作用下的电场力）作用下的差速分离法差速分离法 电泳色谱电泳色谱:将溶质的电动迁移和色谱分离作用相结合的技将溶质的电动迁移和色谱分离作用相结合的技术术 电色谱：电色谱：利用电渗作用驱动流动相流动，依据溶质在固定利用电渗作用驱动流动相流动，依据溶质在固定相和流动相的分配行为差异进行分离相和流动相的分配行为差异进行分离 一般情况下，二者并无严格区别，均称为电色谱一般情况下，二者并无严格区别，均称为电色谱电泳法的发展电泳法的发展2020世纪初期世纪初期 已用于蛋白质的分离已用于蛋白质的分离 7070年代前，主要应用于分析目

3、的年代前，主要应用于分析目的7070年代后，分离制备规模年代后，分离制备规模9090年代后，毛细管电泳和电色谱用于高速分析和年代后，毛细管电泳和电色谱用于高速分析和微量分离制备微量分离制备电泳法的特点电泳法的特点： （1 1）分辩率高）分辩率高, ,属高度纯化技术属高度纯化技术 （2 2）电场作用）电场作用 （3 3）设备放大难，多用于分析（实验室应用）设备放大难，多用于分析（实验室应用）电泳技术的分类电泳技术的分类 根据原理和操作形式可分为根据原理和操作形式可分为： 区带电泳区带电泳 等电点电泳等电点电泳 等速电泳等速电泳 根据是否使用凝胶载体可分为根据是否使用凝胶载体可分为： 凝胶电泳凝胶

4、电泳(Gel electrophoresis)(Gel electrophoresis) 自由流电泳自由流电泳( (Freeflow electrophoresisFreeflow electrophoresis) 以琼脂糖、淀粉胶及以琼脂糖、淀粉胶及聚丙烯酰胺等物质作聚丙烯酰胺等物质作支持体的电泳支持体的电泳。在无固相支持介质在无固相支持介质, ,用特定缓冲用特定缓冲液作为分离介质的分离系统中所液作为分离介质的分离系统中所进行的可溶性分子或不溶性颗粒进行的可溶性分子或不溶性颗粒的电泳分离纯化技术的电泳分离纯化技术 按支持物的装置形式不同，区带电泳可分为按支持物的装置形式不同，区带电泳可分为:

5、 : (1)(1)板式电泳：板式电泳： 水平板式电泳：支持物水平放置，是最常用水平板式电泳：支持物水平放置，是最常用的电泳方式。的电泳方式。 垂直板式电泳：支持物垂直放置垂直板式电泳：支持物垂直放置 (2)(2)柱式电泳：柱式电泳：采用圆柱形凝胶柱，电泳分离后可将凝胶切片，采用圆柱形凝胶柱，电泳分离后可将凝胶切片，回收组份，多用于制备回收组份，多用于制备 电泳的应用电泳的应用： 1 1、分离各种生物产物：如蛋白质、酶、核酸等、分离各种生物产物：如蛋白质、酶、核酸等 2 2、分析某种物质的纯度及分子量、分析某种物质的纯度及分子量e6eZEvr 061eZf krurkr 一、自由溶液中的电泳速度

6、一、自由溶液中的电泳速度U0为迁移率迁移率(mobility)：单位电场强度下带电粒子的泳动速度：单位电场强度下带电粒子的泳动速度当当f=f时时，荷电溶质恒速泳动，则，荷电溶质恒速泳动，则静电引力静电引力 f=EZe黏性阻力黏性阻力 f=6e或e=u0EU0=eZ/6r kr为粒子半径与双电层厚度的比值为粒子半径与双电层厚度的比值Z溶质电荷数溶质电荷数E-电场强度电场强度电子电量电子电量r球形溶质半径球形溶质半径,溶液粘度溶液粘度Ve溶质运动速度溶质运动速度二、凝胶中的电泳速度二、凝胶中的电泳速度 常用的常用的凝胶载体凝胶载体 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶 琼脂糖、淀粉（琼脂糖、淀粉（易发生易

7、发生电渗流电渗流，造成分离度下降，造成分离度下降） 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳速度凝胶电泳速度Lgu=lgu0-KrTgUo为自由溶液中的迁移率为自由溶液中的迁移率Kr为与交联剂浓度有关的凝胶延迟系数为与交联剂浓度有关的凝胶延迟系数Tg 为凝胶浓度为凝胶浓度由丙烯酰胺单体和交由丙烯酰胺单体和交联剂联剂N,N-N,N-亚甲基双亚甲基双丙烯酰胺共聚而成丙烯酰胺共聚而成三、电渗流速度三、电渗流速度电渗流的概念电渗流的概念琼脂糖等凝胶载体在电场作用下琼脂糖等凝胶载体在电场作用下易电离带负电荷易电离带负电荷，其诱导的其诱导的双电层中反离子在电场作用下发生定向双电层中反离子在电场作用下发生定向泳动泳动（

8、向阴极移动），并带动周围的溶剂（水）（向阴极移动），并带动周围的溶剂（水）化层一起泳动，并在摩擦力作用下，化层一起泳动，并在摩擦力作用下，带动主体溶带动主体溶液一起移动液一起移动的现象的现象电渗流驱动的电色谱的流速电渗流驱动的电色谱的流速 流速流速与操作压力无关与操作压力无关，即电渗流不会引起色谱柱，即电渗流不会引起色谱柱压力的增大压力的增大 电渗流速度电渗流速度与固定相粒径无关与固定相粒径无关，电色谱可采用比，电色谱可采用比HPLC更小的固定相粒子（更小的固定相粒子（1.5-5um)电渗流速度公式详见电渗流速度公式详见P366HPLC常采用固定相粒径常采用固定相粒径5四四、影响电泳迁移速度的

9、因素影响电泳迁移速度的因素 样品性质样品性质 电场强度电场强度 缓冲液的性质缓冲液的性质 电渗电渗 温度温度 (1) (1) 样品性质样品性质：带电量，分子大小，形状带电量，分子大小，形状 分子带电量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳分子带电量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快迁移速度越快 (2) (2) 电场强度电场强度：电场强度对电泳速度起着决定性作用，电电场强度对电泳速度起着决定性作用，电场强度越高，电泳速度越快场强度越高，电泳速度越快过高，产热，样品和过高，产热，样品和BufferBuffer扩散增加，条带增宽，蛋白变扩散增加，条带增宽，蛋白变性。性。过低，电泳

10、时间增加，扩散。当需要增大电场强度以缩短过低，电泳时间增加，扩散。当需要增大电场强度以缩短电泳时间时（如高压电泳），需附有冷却装置电泳时间时（如高压电泳），需附有冷却装置 (3) (3) 缓冲液的性质缓冲液的性质 a a 缓冲液的缓冲液的pHpH pH pH 决定带电量，决定带电量，(pH-PI)(pH-PI)越大，带电量越多，迁移速率越越大，带电量越多，迁移速率越大大 b b 离子强度离子强度 I I越大，样品电流减小，迁移率变小；越大，样品电流减小，迁移率变小；I I越小，样品电流越越小，样品电流越大，迁移率越大，但样品易扩散，一般大，迁移率越大，但样品易扩散，一般I I在在0.02-0.

11、02-0.2M0.2M 选择合适的选择合适的pH，使各种蛋，使各种蛋白质所带电荷差异较大，白质所带电荷差异较大，利于彼此分开；电泳过程利于彼此分开；电泳过程中须采用具有一定缓冲能中须采用具有一定缓冲能力的缓冲液使力的缓冲液使pH值恒定值恒定 。 (4) (4) 电渗电渗 当电渗方向与电泳方向一致时，会加快颗粒泳动速度，当电渗方向与电泳方向一致时，会加快颗粒泳动速度，反之，当两者方向相反时，会减慢颗粒泳动速度。反之，当两者方向相反时，会减慢颗粒泳动速度。（5 5）温度：过高，由于产热增加、水分蒸发，对电）温度：过高，由于产热增加、水分蒸发，对电泳不利。泳不利。 凝胶电泳与凝胶过滤的区别凝胶电泳与

12、凝胶过滤的区别： 凝胶电泳：凝胶电泳：样品中各分子的运动速度是小分子快于样品中各分子的运动速度是小分子快于大分子大分子 凝胶过滤凝胶过滤：大分子运动快于小分子：大分子运动快于小分子原因原因：凝胶电泳中：凝胶电泳中,系统里没有空隙体积系统里没有空隙体积,只有网状骨只有网状骨架。大分子物质不及小分子物质容易移动。架。大分子物质不及小分子物质容易移动。 1.1.板式凝胶电泳板式凝胶电泳 处理量很小，不适合生物产物的分离制备。处理量很小，不适合生物产物的分离制备。 水平式平板凝胶电泳水平式平板凝胶电泳垂直式平板凝胶电泳垂直式平板凝胶电泳凝胶电泳的类型凝胶电泳的类型 2.2.圆柱型凝胶柱圆柱型凝胶柱 凝

13、胶切成圆片，分别溶出各个组分。凝胶切成圆片，分别溶出各个组分。 缺点：操作过于繁琐，回收率不高，缺点：操作过于繁琐，回收率不高，且易变性且易变性优点：操作简便，凝胶可重复使用。优点：操作简便，凝胶可重复使用。缺点：回收的溶质浓度很低缺点：回收的溶质浓度很低。连续洗脱凝胶电泳：连续洗脱凝胶电泳：当溶质泳动当溶质泳动到凝胶末端时，通入洗脱液分别到凝胶末端时，通入洗脱液分别回收各个组分回收各个组分。凝胶种类和浓度凝胶种类和浓度电泳槽电泳槽制备胶板制备胶板放置样品梳放置样品梳加样加样电泳电泳观察和拍照观察和拍照凝胶电泳操作步骤凝胶电泳操作步骤制胶或染色时加制胶或染色时加入的染料入的染料EBEB是强是强

14、诱变剂并有中等诱变剂并有中等毒性，配制和使毒性，配制和使用时都应戴手套用时都应戴手套M 1 2 3 4PCR产物的产物的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳二、不连续凝胶电泳二、不连续凝胶电泳不连续凝胶电泳的分离原理： 1、样品的浓缩效应 1）凝胶层的不连续性 2）缓冲液离子成分的不连续性 2、电荷效应 各种蛋白质所带电荷不同，有效迁移率也不同 3、分子筛效应 凝胶浓度不同， 网孔径大小不同。 分子量和构型不同的蛋白质分子，通过一定孔径的凝胶时所受阻力不同，引起泳动速度的变化，从而达到分离目的。 影响因素： 1、聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小 2、缓冲系统 3、离子强度 不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离

15、胶所组不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。成。不连续电泳的三个不连续性：不连续电泳的三个不连续性：a.a.凝胶浓度的不连续性凝胶浓度的不连续性( (分离胶浓度分离胶浓度 浓缩胶浓缩胶）b.b.缓冲液缓冲液pHpH值的不连续性值的不连续性 c.c.缓冲液离子成分的不连续性缓冲液离子成分的不连续性不连续电泳的不连续性不连续电泳的不连续性浓缩层凝胶缓冲液为浓缩层凝胶缓冲液为pH6.8的的Tris-HC1；分离层凝胶缓冲；分离层凝胶缓冲液为液为pH8.9的的Tris-HC1；电极；电极缓冲液是缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸甘氨酸-HC1缓冲液。缓冲液。电荷因素分子大小分子形状分子形状和

16、大小相同，分子形状和大小相同，所带电荷性质和数量不所带电荷性质和数量不同同分子形状和所带电荷性质分子形状和所带电荷性质和数量相同，分子大小不和数量相同，分子大小不同同分子所带电荷性质和数量分子所带电荷性质和数量相同，分子形状不同相同，分子形状不同 原理原理：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，迁移率取决于：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，迁移率取决于其所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果在丙其所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果在丙烯酰胺凝胶系统中烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate,(sodium do

17、decyl sulfate,简称简称SDS)SDS)，则蛋白质分子的，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形，而与所带电荷和形状无关。因此可以利用状无关。因此可以利用SDS-PAGESDS-PAGE测定蛋白质分子量测定蛋白质分子量。 等速电泳的特点等速电泳的特点 (1)(1)各个各个组分间形成相互连接的独自区带组分间形成相互连接的独自区带，可有效抑制扩散，可有效抑制扩散引起的区带分散现象。引起的区带分散现象。 (2)(2)提高前导电解质浓度，可提高溶质的浓缩率。提高前导电解质浓度，可提高溶质的浓缩率。 (3)(3)采用适当的采用适当的低分子

18、两性电解质低分子两性电解质，在目标蛋白质前后作，在目标蛋白质前后作间间隔物隔物，可使目标蛋白与其他蛋白质完全分离，得到高度纯，可使目标蛋白与其他蛋白质完全分离，得到高度纯化。化。 定义：一种利用具有连续pH梯度的支持介质分离等点电不同的蛋白质的电泳技术。等等 电电 聚聚 焦焦 电电 泳泳 在电泳介质中放入在电泳介质中放入载体两性电解质载体两性电解质，当通以直流电时，当通以直流电时，两性电解质即形成一个两性电解质即形成一个由正极到负极逐步增加的由正极到负极逐步增加的pHpH梯度梯度，正极附近是低正极附近是低pHpH区，负极附近是高区，负极附近是高pHpH区。区。 蛋白质（和氨基酸）等两性电解质具

19、有等电点，在等电蛋白质（和氨基酸）等两性电解质具有等电点，在等电点的点的pHpH值下呈电中性，不发生泳动。因此，在此体系中，值下呈电中性，不发生泳动。因此，在此体系中，不同的蛋白质即移动到或不同的蛋白质即移动到或聚焦于其相应的等电点位置上聚焦于其相应的等电点位置上，形成具有不同等电点的蛋白质区带形成具有不同等电点的蛋白质区带pI1pI2pI3 pIn- -+ +有一个在电泳条件下基本稳定、重复性良好的连有一个在电泳条件下基本稳定、重复性良好的连续续pHpH梯度梯度有一个抗对流的电泳材料，使已经分离的样品不有一个抗对流的电泳材料，使已经分离的样品不再重新混合再重新混合电泳后有适当的方法来鉴定分离的区带电泳后有适当的方法来鉴定分离的区带凝胶中加有凝胶中加有两性电解质两性电解质溶液（溶液（pH9-3） 加电场加电场后在凝胶内后在凝胶内形成一个稳形成一个稳定定pH梯度梯度 加样品，加样品，然后继续然后继续电泳电泳凝胶染色表明凝胶染色表明样品按照各自样品按照各自pI值沿着值沿着pH梯度分布梯度分布等电聚焦示意图等电聚焦示意图（一）优点（一）优点1.1.分辨率高分辨率高 分辨率较不连续分辨率较不连续PAGEPAGE更高更高（精密度可达（精密度可达0.01pH0.01