南京农业大学生化课件RNA生物合成

1、DNA的复制复制部位：真核生物：原核生物：细胞质dATP n2dCTPDNA 聚合酶.ctc( " DNA+ (nrio+no+nJ PPin3d GTPDNA模板1 2 3 4，n4d TTP JPPi随即被焦磷酸酶水解，从而推动聚合反应的进行。（二）复制的方式半保留复制DNA复制时，亲代DNA的双螺旋先解旋并分开,然后以每条链为模板，按照碱基配对原则，各形 成一条互补链。这样，从亲代的一个DNA双螺旋分 子复制成两个与亲代的碱基序列完全相同的子代 DNA分子。每个子代DNA分子中，有一条链来自亲 代DNA,另一条则是新形成的，这样的复制方式叫做半保留复制(semiconserva

2、tive replication )。(-)复制的方式半保留复制Afrrr onr. V.cr mo(二)复制的方式一.DNA的复制如何证明半保留复制1958年，Meselson 证明：用，nh4cl唯一氮源培养大肠杆菌，之后，用i4|MH4a培养，然后进行 CsCIz进行密度梯度离心。由于15NH4cl密度大于 14nh4cl因此，形成不同区带，经过若干代培养 后，两个14NH4cl区带增多。（=）复制反应注意点.DNA的复制CsCl梆度亲代中-DNABX,5N -DNAl4N -DNA,4N,15N -DNA(-)复制的方式,5N -DNA（重）DNAOngiual parvnlmolec

3、ule|4N.I5N -DNA（中等）Hybrid DNA （15N_14Ni First-fteneration daughter molecules7 ,4N -DNA、（轻）l4N, l5N-DNA（中等）Socond-goneraUon daughter moleculesLight DNArNi Hybrid DNADNA的复制CsCl梯度亲代,JN -DNA,4N?5N -DNAw,5N-DNA（£）|4NJ5N-DNA仲等）一弧-DNA,4NJ5N -DNAMN -DNA（轻）,4Nt ,5N-DNA（中等）一味 -DNA半保留复制全保留复制DNA复制除入DNA聚合酶，

4、DNA模板， dNTP外，还需要多种蛋白质因子、引物 、Mg2+等.特点：A对利福平不敏感B核糖核酸代替脱氧核糖核酸（四）参与复制的碎和蛋白质：一.DNA的复制1. DNA聚合酶（DNA polymease）DNA聚合酶原核生物DNA聚合酶IDNA聚合酶nDNA聚合酶m催化活性53，35，5，f3z聚合 核酸外切核酸外切+功能切去引物RNA,补上正确的DNA片段与修复有关（活性低）负责链的延长（活性高）TABLE 25-1 Comparison of DNA Polymerases of E. coliDNA polymeraseIIIIIStructural gene*polApolBpol

5、C (dnaE)Subunits (number of different types)17N10103,00088f000f791,5003f >5r Exonuclease (proofreading)YesYesYgs5'3' ExonucleaseYesNoNoPolymerization rate (nucleotldes/s)16-2040250-1.000Processlvlty (nucleotides added3-2001,500三500,000before poMnerase dissociates)More than 90 % of the DNA

6、 polymerase activity obsen edin E. coli extracts can be accounted for by DNApolymerase I(四)参与复制的酶和蛋白质一.DNA的复制TABLE 25-2 Subunits of DNA Polymerase III of F. coliNumber ofsubunits perSubunit holoenzyme Mr of subunit Gene Function of subunit129.90027,500poiC (dnaE) dnsQ (mutO)Polymerization activity3&

7、#39;f 5' Proofreading exonuclease, Core polymerase8.600holEA71,100dnaXStable template blndlig: core enzyme dimerizationClamp-loading (7) complex that47.500dnaXClamp loaderloads fi subunits on lagging38,700holAClamp openerstiund at each Okazaki fragment36.900holBClamp loader16.600holCInteraction

8、with SSB15.200holDInleractlon with y anc x40,600dnaNDNA clamp required foroptimal processMVDNA polymerase III is much more complex than DNApolymerase I, having ten types of subunits（四）参与复制的酶和蛋白质I .DNA的复制p clampii clamp (open)（四）参与复制的酶和蛋白质2. DNA聚合酶(DNA polymease)催化活性功能DNA聚合酶 5-3' 3, 一 5， 5Z - 3,聚

9、合 核酸外切核酸外切真核生物DNA聚合酶aDNA聚合晦。DNA聚合悔DNA聚合酶5+切去引物RNA,补上正确的DNA片段负责链的延长负责先导链的延长5, Primer strand1 () 力 CH”,(>HOH<>OIIIIp (> p - <>-1'171)厂(厂()()5| CH” <C1Ircmplale-X>«iscTBaseyBA1Bas<Basc-»_Mismatched /ybasesExonuclease ( hydrolysis site.rr!DNA polymerase 1Every ce

10、ll contains several different nucleases （核 酸酶），belonging to two broad classes: exonucleases （核 酸外切酶）and endonucleases （核 酸内切 酶）. Exonucleases degrade nucleic acids from one end of the molecule.核酸夕卜切 Exonucleases degrade nucleic acids from one end of the molecule> Many operate in only the 5 '一

11、 3 ' or the 3'5' direction, removing nucleotides only from the 5' or the 3' end, respectively, of one strand of a doublestranded nucleic acid or of a single-stranded DNA>（四）参与复制的酶和蛋白质.DNA的复制Endonucleases can begin to degrade at specific internal sites in a nucleic acid strand

12、or molecule, reducing it to smaller and smaller fragments. A few exonucleases and endonucleases degrade only singlestranded DNA. There are a few important classes of endonucleases that cleave only at specific nucleotide sequences.Nick弋子 RNA ur DNA（四）参与复制的酶和蛋白质53'3,535，dNTPs53' 53I忖Template D

13、NA strandDNA polymerase IdNMPsorrNMPb5, -3,核酸外切5,一. DNA的复制DNA Replication Requires Many Enzymes andProtein FactorsReplication in E. coli requires not just a single DNA polymerase but 20 or more different enzymes and proteins, each performing a specific task. The entire complex has been termed the DN

14、A replicase system or replisome> The enzymatic complexity of replication reflects the constraints imposed by the structure of DNA and by the requirements for accuracy.（四）参与复制的酶和蛋白质一.DNA的复制DNA Replication Requires Many Enzymes andProtein FactorsTABLE 25-3 Proteins Required to Initiate Replication

15、at the £ coll OriginNumber ofProteinMrsubunitsFunctionDnaA protein52,0001Recognizes on sequence: opens duplex at specific sites inoriginDnaB protein (helicase)300,0006*Unwinds DYADnaC protein29.0001Required for DnaB binding at odglnHU19.0002Histonellke protein: DNA-blndlng protein: stimulates I

16、nitiationPnmase (DnaG protein)60,0001Synthesizes RNA primersSingle-stranded DNA-bindingprotein (SSB)75,6004.Binds single-stranded DNARNA polymerase454,0005Facilitates )naA activityDNA gyrase (DNA topoisomerase II)400,0004Reliefs to sional stiam generated by DNA unwindingDam methylase32,0001MetTylale

17、s (5'>GATC sequences at oriC（四）参与复制的酶和蛋白质一.DNA的复制2.引物酶（primer）合成RNA引物,又叫引物合成酶、引发酶。它以单链DNA为模板，以ATP、GTP、CTP、UTP 为原料，从方向合成出RNA片段，即引物。（四）参与复制的酶和蛋白质3. DNA连结酶（DNA ligase）催化DN4双链中一条链上的缺口（3'-OH与 它下游相邻的核甘酸的5-磷酸之间）共价连结（ 形成磷酸二酯键）。连结过程需要能量，和某些细菌中由 NAD+提供；动物细胞由ATP提供。（四）参与复制的酶和蛋白质一,DNA的复制4. DNA连结酶(DNA

18、ligase)Nirotinainidc or nu »noniiclcoti<le (卜:qW)(phage T4>(ctikarvotcs)or ATP(phage* *1 I) (ciikai veiled)Adenosine ()XI l23r$Xi< k<<d 1) !：於:Ni< kr<l l>N (四)参与复制的酶和蛋白质.DNA的复制5. 使DNA双螺旋解开的酶和蛋白质；解螺旋酶(helicase):将DNA的两条链打开。每解开一对碱基需要 水解2分子ATP。方向为3 -3，,大肠杆菌中的 解螺旋酶又叫rep蛋白，但方向

19、为3，-5，。(四)参与复制的酶和蛋白质.DNA的复制4.使DNA双螺旋解开的酶和蛋白质；单链结合蛋白(SSBP):与解链后的DNA单链结合，阻止其再次形成双 螺旋。大肠杆菌S6B为177 aa多肽，以四聚体形 式存在，与32个bp DNA区相结合，结合后的DNA 分子僵硬，不易 弯曲，有利于单链DNA分子的稳 定，避免核酸酶进攻；同时降低了Tm值，进一步 促进DNA的解链。（四）参与复制的酶和蛋白质-DNA的复制4使DNA双螺旋解开的酶和蛋白质* 旋转酶（gyrase,untwisting protein）： 催化DNA的拓扑连环数发生变化。可分为拓扑异构酶I和拓扑异构酶n。I型酶可减少负超

20、螺旋；II型酶可引入负超螺旋（ 此时需要ATP提供能量）。具有内切酶和连接酶活力 ,参与DNA复制前双螺旋的松弛及复制后超螺旋的再 恢复。（四）参与复制的酶和蛋白质三DNA的复制4使DNA双螺旋解开的酶和蛋白质* dnap蛋白（mobile promoter）：功能：识别DNA的合成的起始位置，与引物酶及其 它一些蛋白组成复合体启动RNA引物链的合成。（五）复制的过程.DNA的复制1 .复制的启动复制从特定的位点开始，这一位置叫复制原点°原核生物的DNA上一般只有一个复制原点，但在 迅速生长时期，第一轮复制尚未完成，就在起点处启 动第二轮复制；真核生物则有多个复制原点，可以同时启动复

21、制 过程。（五）复制的过程.DNA的复制2 .复制的启动复制过程的调控主要取决于复制启动的频率， 而DNA延长的速度大体上是恒定的。由于真核生物 在多位点上启动复制，所以尽管其DNA比原核生物 DNA大得多，但复制的总速度反而比原核生物快。DNA的复制是由引发体识别并结合于复制原点 而被启动的，其机理比较复杂，目前还不十分明了DNA的复制（五）复制的过程3 .复制眼的形成由于复制原点都是在DNA分子的内部，而不是在 末端，所以当复制启动后需要在复制原点处将DNA双 螺旋局部解链，形成“眼状”结构复制眼。DNA的复制（五）复制的过程2 ,复制眼的形成 复制眼的结构：复制眼形成后，其两端的叉子状结

22、构称为复制叉。（五）复制的过程| . DNA的复制2 .复制眼的形成-双螺旋解开的过程解螺旋酶使DNA双螺旋局部解链；SSB结合到解开的单链上；拓扑异构酶n向DNA中引入负超螺旋，以消除由 解链产生的扭曲张力（动画）。双螺旋DNAX切开双琏中公Topi X的一条链形（-）q ：；成DNA-磷酸结合Topi酪纨共价键3，5，1带切开的3'端单链穿越 与另一条连Top 1被解离2个负超螺旋DNA-醐中间物(b)切断后面（+） 的双能(-)双上链口 的至断封 断起原接 切穿与连(c)（五）复制的过程.DNA的复制3 .复制叉的推进 （1）复制叉推进的方式随着复制叉的推进，两条新链的合成方向是

23、不同的：一条链延伸的方向与复制叉前进的方向一致，它的合成 能连续进行，称为前导链；（五）复制的过程.DNA的复制3.复制叉的推进-复制叉推进的方式另一条链延伸的方向与复制叉前进的方向 相反，它显然不能被连续合成，需要复制叉推 进了 一定的长度，有了一段DNA单链后，才能 以此为模板合成一个片段。因此这条新链的合 成是不连续的，而且总晚于先导链，所以称为 随后链。（五）复制的过程DNA的复制3.复制叉的推进-复制叉推进的方式这种前导链连续合成，随后链断续合成的 方式，称为半不连续复制。随后链中合成的多个DZA片段，称为冈崎 片段。冈崎片段的长度原核细胞中约 10002000个核昔酸，真核细胞中约

24、 1。200个核昔酸。（五）复制的过程.DNA的复制3.复制叉的推进-复制叉推进的过程先导链的合成引物酶在复制原点附近合成一段RNA 引物；DMA聚合酶in （原核细胞）在引物的 3末端逐个添加脱氧核甘酸。随着复制叉的推进，亲代DNA双螺 旋不断被解开，先导链也不断延伸。（五）复制的过程.DNA的复制3.复制叉的推进-复制叉推进的过程随后链的合成引物的合成：随后链的每个冈崎片段都需要合成 RNA引物。也是由引物酶催化。冈崎片段的合成：DNA聚合酶m（原核细胞）在引物的 3'末端使DNA链延伸，直至抵达其 下游的另一个冈崎片段的RNA引物 的51端。（五）复制的过程I . DNA的复制3

25、.复制叉的推进-复制叉推进的过程随后链的合成冈崎片段的连结：DNA聚合酶I 一面以其DNA聚合活 性在上游冈崎片段的3，OH末端添加 脱氧核甘酸，一面以其5,一3,核酸外 切活性切除引物，直至将引物全部切 除。DNA连接酶将最后的缺口补好。（五）复制的过程I . DNA的复制3.复制叉的推进-复制叉推进的过程 先导链和随后链中DNA的延伸由同一个DNA聚合酶ID全酶二聚体催化随后链的模板回折成环，从而使冈崎片段的延伸 方向与先导链的延伸方向一致，它们的31末端分别落 在DNA聚合酶ID全酶的双活性部位。因此，随着聚合 酶的移动，两条链同时延伸。SSBRNA primerDnaB helicaseDNA primascDNA topoisomerase II (DN.ALeading strand synthesis <DMA polymerase 111)cation fork movement3'5Lagging strand 3一 5"RNA primer frum previous Okazaki fragment（五）复制的过程4 .复制的结束rLagging strand synthesis(DNA jM