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文档简介

1、pcr扩增的原理和步骤一、根本原理：PCR技术的根本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依 赖于与靶序列两端互补的寡核甘酸引物.DNA的半保存复制是生物进化和传代 的重要途径.双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链,在 DNA聚合 酶的参与下,根据碱基互补配对原那么复制成同样的两分子拷贝.在实验中发现,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性 成为双链.因此,通过温度变化限制 DNA的变性和复性,参加设计引物,DNA 聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制.二、PCR由变性-退火-延伸三个根本反响步骤构成：1、模板DNA的变性：模板DNA经加热至93 c左右一定

2、时间后,使模板DNA 双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合, 为下轮反响作准备.2、模板DNA与引物的退火复性：模板 DNA经加热变性成单链后,温度 降至55 c左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合.3、引物的延伸：DNA模板-引物结合物在72 C、DNA聚合酶如TaqDNA 聚合酶的作用下,以dNTP为反响原料,靶序列为模板,按碱基互补配对与 半保存复制原理,合成一条新的与模板 DNA链互补的半保存复制链重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保存复制链,而且这种新链又可成为下次循环的模板.每完成一个循环需24分钟,23小时就能将待扩目的基因

3、扩增放大几百万倍.Polymerase chain reaction - PCRrigiMl tXNA 崂be*第l/M期DMA prtTiet7r sAnncjling -i&B'C扩展：在实践中,聚合酶链式反响PCR可以因各种原因而失败,局部原因是由于其 对于污染的敏感性,导致扩增错误的 DNA产物.正由于如此,人们已经开发了 一些技术和步骤来优化聚合酶链式反响条件.将聚合酶链式反响前的混合物与潜 在DNA污染物分开的实验室方案和流程解决了外源 DNA的污染问题.这通常包括从用于分析的区域分理出聚合酶链式反响的设定区域或者说聚合酶链式反响产物的纯化,一次性塑料制品的使用,及对反响装置之间的工作台面彻 底清洁.引物的设计技术在改善聚合酶链式反响产物产率和防止杂产物的形成是 很重要的.替代缓冲成分和聚合酶的使用有助于较长或存在其他问题的DNA区域的扩增.在缓冲体系中参加试剂,如甲酰胺,或会增加聚合

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